研究背景与目的:
　　人多能干细胞向心肌分化为体外研究人类心脏发育提供了独特的机会，为心脏再生提供了潜在的细胞来源。然而，与研究心脏成熟和心肌细胞亚型特异性诱导的大量研究相比，多能干细胞早期心肌谱系命运决定的分子事件机制研究仍然欠缺。另一方面，能够催化染色质结构发生改变的酶——染色质重塑复合物，通常组装成多亚基的复合体来发挥功能，对于真核生物的基因转录、细胞周期发展、DNA复制和损伤修复具有至关重要的意义。尽管染色质重塑复合物对于心脏正常发育很重要，但染色质重塑复合物在心肌分化过程中如何行使其功能的机理仍知之甚少。研究报道，作为SWI/SNF染色质重塑复合物四大家族之一的INO80复合物可参与许多生物学过程，包括DNA修复、转录和复制中起着重要的调控作用。INO80复合物可以结合在胚胎干细胞主要转录因子基因的启动子区域，保持染色质区域的开放，已经发现INO80复合物突变与心血管疾病有关，但尚未探索INO80复合物在体外心肌分化过程中的作用。本研究旨在利用单细胞测序技术从单细胞水平探究早期心肌细胞命运决定过程以及探究染色体重塑复合物INO80调控心肌命运决定过程中的作用机制。
　　研究方法:
　　采用单细胞测序对分化过程中六个关键时间点(T0、T2、T5、T9、T14、T60)细胞进行单细胞测序;进一步通过免疫荧光技术验证T5四类细胞亚群代表蛋白的表达;构建shRNA敲低ETS1、INO80表达，通过定量RT-PCR检测心肌特异性基因表达变化;RNA-seq分析敲低INO80后差异基因的表达;采用ChIP-seq，Mnase-seq进行机制研究。
　　研究结果:
　　为揭示在分化过程中从多能干细胞状态下控制心肌谱系命运决定的关键分子事件和调控因子，我们首先对心肌分化过程中不同阶段细胞进行了单细胞RNA-Seq测序，获得了人类胚胎干细胞心肌分化过程6个阶段的6879个单细胞的高质量数据，并鉴定了具有明显分子特征的多个细胞亚群，包含有多能干细胞亚群、早期中内胚层细胞亚群、晚期中内胚层细胞亚群、心肌祖细胞亚群、内胚层样细胞亚群、心肌细胞亚群等。通过构建心肌分化的发育轨迹图谱和假定的配体-受体相互作用分析，我们发现T5的内胚层细胞存在调节心肌祖细胞的潜在的旁分泌途径，这可能为第5天的心肌谱系命运决定提供一个细胞微环境。此外，单细胞RNA测序数据的计算分析揭示了ETS1(ETS原癌基因1)的激活是由心肌祖细胞和内胚层细胞间的相互联系引起的一个重要的下游分子信号事件。与单细胞分析的结果一致，针对ETS1染色质免疫沉淀的高通量测序(ChIP-Seq)显示ETS1在第9天和第14天的心脏结构基因中的基因组的占位，而构建shRNA敲低ETS1则显著影响心肌分化过程。
　　Westernblot检测发现在心肌分化过程中染色质重塑复合物INO80在心脏祖细胞阶段表达显著上调，并调节了心肌谱系命运决定的关键调控基因的转录。通过对心肌分化的每个关键阶段进行INO80的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)，确定了INO80的5种全基因组结合模式，其中群集4显示出从多能干细胞阶段到心肌细胞阶段结合逐渐增加，该群集基因显著富集在心肌发育通路上。蛋白质组学分析揭示了心肌分化过程中INO80亚基的独特组合组装。我们的数据进一步确定了BRG1，SWI/SNF染色质重塑核心亚基，与目标基因的转录调控所需的INO80发生物理相互作用并在功能上相互合作。与表观遗传动力学的联合分析阐明了INO80和H3K4me3在心肌分化中的相互作用。最后，构建shRNA敲低INO80会导致终末分化心肌细胞的生长迟缓。
　　研究结论:
　　本研究不仅揭示了体外心肌分化过程中不同细胞类型的分子特征，确定了ETS1是由细胞间相互联系引起的心肌谱系命运决定过程中的关键因素，并且发现了INO80对于诱导心脏祖细胞过程中关键的心脏特异性基因的转录激活至关重要，同时建立了不同的依赖ATP染色质重塑复合物在人类胚胎干细胞心肌分化中的相关性，从而为了解人类胚胎早期心脏发育以及再生医学中心脏分化的定向操控提供了重要实验依据和理论基础。