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多病原的混合感染是目前全球猪病流行的主要特点之一,其中较为常见的是PRRSV和PCV2的混合感染,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。目前,防制猪病毒性传染病的主要措施仍是接种疫苗,但PRRSV和PCV2均为免疫抑制性病毒,常导致疫苗免疫失败。本课题组通过建立病毒感染细胞模型,筛选具有抗病毒作用的天然化合物,结果显示苦参碱具有抗PRRSV感染Marc-145细胞的作用。本研究进一步证明了苦参碱是通过抑制PRRSV N蛋白的表达来发挥其抗病毒作用。其次,前期的筛选结果也表明苦参碱可通过抑制PCV2的CAP蛋白来干扰PCV2在PK-15细胞的增殖。因此,本试验分别建立PRRSV/PCV2共感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)模型和昆明小鼠模型,研究苦参碱抗PRRSV/PCV2共感染的作用及其机制。PRRSV/PCV2共感染PAM细胞模型的试验结果表明：1.qPCR分别检测PRRSV和PCV2单独感染或混合感染PAM细胞中PRRSV N基因和PCV2 CAP基因表达量的变化。结果表明PRRSV和PCV2在单独感染或混合感染PAM细胞上的增殖规律一致。PRRSV在PAM细胞的增殖规律呈先上升后下降的变化趋势。在病毒感染的12 h,病毒载量达到最大,PRRSV单独感染或混合感染PAM细胞时,N基因copy数分别为7.82×104copies/μl和1.11×105 copies/μl。而PCV2在PAM细胞的病毒载量随感染时间延长而增多,在72 h时趋于稳定,CAP基因copy数在PCV2单独感染和混合感染PAM细胞时,copy数分别为3.78×107 copies/μl和6.10×107copies/μl。与PRRSV、PCV2单独感染相比,PAM细胞先接种PRRSV再接种PCV2能显著促进PRRSV和PCV2在PAM细胞上的增殖(p<0.05)。2.用CPE法和MTT法测定苦参碱对PAM细胞的细胞毒性。在试验中所使用的浓度范围内(0.0625 mg/m1-4 mg/m1),苦参碱在PAM细胞上的最大安全浓度为0.4 mg/ml,当浓度高于0.4 mg/ml时,可致PAM细胞呈现不同程度的细胞空泡化病变。3.用qPCR和Western blot检测PRRSV N基因、蛋白和PCV2 CAP基因的表达。结果表明苦参碱是通过抑制PRRSV N基因／蛋白表达及PCV2 CAP基因表达而降低PAM细胞中PRRSV与PCV2的病毒载量。其中,PRRSV N基因copy数在PRRSV/PCV2共感染组时为1.37×106 copies/μl,而0.4 mg/ml苦参碱处理组的copy数降至2.44x105copies/μl (p<0.05)。 PCV2 CAP基因copy数在PRRSV/PCV2共感染组时为2.12x105copies/μl,而0.4 mg/ml苦参碱处理组的copy数降至1.12×105copiesμl (p<0.05).同时,PRRSV/PCV2共感染PAM细胞12h能够激活NF-κB通路,并引起TLR3、TLR4以及TNF-a表达量升高(p<0.05),而苦参碱可通过抑制病毒诱导的TLRs/NF-κB/TNF-α通路发挥其抗病毒作用。PRRSV/PCV2共感染昆明小鼠模型的研究结果表明：4.昆明小鼠先接种PRRSV后接种PCV2可建立PRRSV/PCV2共感染小鼠模型。PCR结果显示在共感染小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺以及腹股沟淋巴结中均检测到PRRSV N基因和PCV2 CAP基因。qPCR结果表明PCV2在小鼠肝脏中的表达量最高(5.66×103copies/μl),其次是胸腺(2.21×103copies/μl)和脾脏(1.17×103copies/μl)。虽然PRRSV在小鼠体内广泛存在,但qPCR结果表明PRRSV并没有在体内大量增殖。因此,在抗病毒试验中以检测PCV2载量变化为主。然而,与PCV2单独感染相比,PRRSV的感染能够显著促进PCV2在小鼠体内的复制(p<0.05),并加重PCV2感染诱导的间质性肺炎。5.通过急性毒性试验确定昆明小鼠腹腔注射苦参碱的安全剂量为40 mg/kg。从攻毒后的第7d开始,连续5d腹腔注射苦参碱。qPCR检测结果显示苦参碱可显著降低PCV2在肝脏中的复制(p<0.05),并减轻病毒感染引起的间质性肺炎。结果提示苦参碱可通过直接干扰病毒复制来发挥其抗病毒作用。6.在病毒感染昆明小鼠的第10、13和16d时,苦参碱在10 mg/kg时可显著促进小鼠体增重(p<0.05);在病毒感染13和16 d时,苦参碱可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力(p<0.05)：在病毒感染16d时,40 mg/kg苦参碱可增加小鼠脾脏淋巴细胞增殖指数(p<0.05)。这些结果表明苦参碱可通过增强机体的免疫功能以降低病毒感染对小鼠的影响。本研究证实：苦参碱具有抗PRRSV/PCV2混合感染的作用,并阐明了其抗病毒作用的部分机制,不仅为PRRSV和PCV2的防治提供了新的途径,也为苦参碱作为新兽药的开发利用奠定基础。