论文部分内容阅读
目前,β肾上腺素受体激动剂(简称β激动剂)的违禁添加依然是影响我国畜产品安全的主要因素之一。尤其是混合添加及新型类似物的层出不穷给监管带来巨大挑战,迫切需要针对该类违禁物的多残留快速检测技术。本研究基于受体识别技术,克隆得到猪β2AR基因,并进行体外表达体系筛选,以纯化的受体蛋白为识别元件,建立了同时检测克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等的直接竞争酶受体分析法,研究内容及结果如下:1.猪β2AR基因克隆和序列分析。c DNA和DNA两序列均为1257 bp,编码418个氨基酸,与已发表猪β2AR序列基本一致,活性位点处的氨基酸均正确克隆。生物信息学分析可知,克隆基因符合β2AR的结构特点。同源性比较和系统进化树分析显示,猪与其它物种的β2AR同源性较高,与领西猯亲缘性最为接近。2.猪β2AR基因的最适表达体系和条件筛选。将野生型和改造后的猪β2AR基因在毕赤酵母X-33菌株、大肠杆菌BL21菌株和哺乳动物细胞HEK293进行表达比较研究及表达条件的优化。经SDS-PAGE和Western blot蛋白表达量检测,以及ELISA试验蛋白活性鉴定,结果表明:重组穿梭表达质粒p Tri Ex-1.1 Hygro-β2AR1-418转染的HEK293细胞表达量较高,表达产物粗蛋白活性最高,检测3种β激动剂HRP酶标记物的OD值分别为0.872、0.652和0.848。因此确定其为最适表达体系,最佳表达时间为转染后72 h。3.受体蛋白制备及纯化。经裂解和溶膜后制备粗膜蛋白,并进一步采用镍离子亲和层析法纯化得到受体蛋白。Western blot和SDS-PAGE结果表明:咪唑的最佳洗脱浓度为250 mmol/L,在47 KD左右出现了特异性条带,受体蛋白纯度大于80%。活性鉴定显示:受体蛋白与3种β激动剂的HRP酶标记物均能特异性结合,亲和性由强到弱依次为酶标克伦特罗>酶标沙丁胺醇>酶标莱克多巴胺。四板细胞培养皿(15 cm)的HEK293细胞可纯化得到160μg受体蛋白,约占粗膜蛋白的4.4%。4.基于重组β2AR受体蛋白的β激动剂直接竞争酶受体分析法(ELRA)构建。优化后的工作条件为:受体蛋白和HRP-克伦特罗分别以1:10和1:500倍稀释,包被液和封闭液分别为碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L,p H 9.6)和1%BSA,封闭条件为4℃过夜封闭。包被纯化受体蛋白和粗膜蛋白均能实现对3种β激动剂的定量检测,在1μg/L~1000μg/L浓度范围内,包被受体蛋白的ELRA方法线性关系更优,R2值分别为0.9933,0.9953和0.9966。方法学评价结果显示,最低检出限LOD值为4.49μg/L;检测3种β激动剂的IC50值分别为32.13μg/L、96.11μg/L和71.43μg/L,莱克多巴胺和沙丁胺醇与克伦特罗之间的交叉反应率分别为33.4%和45.0%,说明该方法适于多残留检测;猪尿样品中3种β激动剂的平均回收率分别为68.2%、60.3%和65.5%;重复性试验中变异系数均小于15%,重复性较好。综上所述,本研究建立了检测尿液基质中3种β激动剂的直接竞争酶受体分析法,为β2AR在β激动剂多残留检测中的研发和应用提供了科学依据。