鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌属的致病性沙门氏菌引起的细菌性传染病,具有垂直传播、雏鸡死亡率高等特点,给禽类养殖业带来严重的经济损失。喹赛多是具有防治动物疾病并且能够改善生产性能的喹嗯啉类新品种药物,对畜禽及鱼类均具有广谱抗菌和提高饲料利用率的作用。喹赛多对鸡沙门氏菌具有优良的抗菌活性,提示其具有应用于防治鸡沙门氏菌感染的应用前景。然而,科学的合理给药方案尚待建立。PK-PD模型可以综合反映宿主、药物和病原菌三者之间的关系,能够指导临床用药在达到最佳疗效的同时降低耐药菌的产生。本研究通过开展喹赛多对鸡沙门氏菌体外和半体内药效研究以及喹赛多在鸡回肠内的代谢动力学研究,采用WinNonlin软件拟合喹赛多对鸡沙门氏菌的PK-PD模型,制定喹赛多治疗鸡沙门氏菌性腹泻的合理给药方案,为喹赛多在临床上的合理应用提供理论依据。1喹赛多对沙门氏菌cvcc528的抗菌活性研究采用CLSI相关文件推荐肉汤稀释法测定喹赛多及其主要代谢物(Cy1、Cy2、 Cy4、Cy6、Cy9、Cy12)分别在MH肉汤和鸡回肠内容物中对沙门氏菌cvcc528的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明,喹赛多在厌氧条件下具有较好的杀菌作用,在MH肉汤中其MIC和MBC分别为2μg/mL和4μg/mL;在回肠内容物中喹赛多的MIC也为2μg/mL。其主要代谢物中只有Cy9(2-甲酰甲酰腙-喹嗯啉-N1,N4-二氧化物)具有抗菌活性,在MH肉汤中Cy9的MIC也是2μg/mL。根据喹赛多对cvcc528的最低抑菌浓度(MIC)结果,配制1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC的系列喹赛多浓度肉汤进行杀菌实验,接种细菌后各组的细菌浓度均为106CFU/mL,厌氧条件下培养1、2、4、6、8、12、24h后分别取出100μL,梯度稀释后用倾倒法计数,绘制抑菌曲线。结果表明,喹赛多抑菌曲线与已知为浓度依赖型的氟喹诺酮类抗生素类似均随药物浓度的增加,杀菌活性增大,杀菌时间变短。这表明喹赛多对沙门氏菌的杀菌类型为浓度依赖型。采用药物和细胞共同孵育的方法测定喹赛多对细胞内沙门氏菌的药效：采用的细胞为对沙门氏菌易感的RAW264.7,用沙门氏菌进行感染,加入庆大霉素以杀灭胞外菌,更换细胞培养液后构建感染细胞体系。将其与2、8、20μg/mL的喹赛多共同孵育。在4h、8h、24h后吸出培养液,用细胞裂解液裂解细胞以释放出胞内菌,梯度稀释后进行活菌计数,绘出抑菌曲线。实验结果显示,与空白对照组比较,喹赛多组能明显抑制细胞内沙门氏菌的生长,并且随着药物浓度的增加抑制作用增强,当添加药物浓度达到20μg/mL时细胞内细菌不再增殖。采用药物去除的方法测定喹赛多对cvcc528的抗生素后效应(PAE)：将沙门氏菌与浓度为1×MIC、2×MIC、4×MIC喹赛多接触一定时间后,采用高度稀释的方法去除药物,取除药后的菌液加入肉汤培养基,然后于不同时间点取培养液进行细菌计数。建立不同浓度处理后沙门氏菌恢复生长的动力学曲线。按照公式PAE=T-C计算抗菌药后效应的长短。结果表明,喹赛多不具有抗生素后效应,当喹赛多药物浓度达到4MIC与沙门氏菌接触2小时后细菌已被完全杀灭,重建后没有检测到细菌。采用琼脂平板法测定喹赛多对cvcc528的最小防突变浓度(MPC)：配制含喹赛多系列浓度的琼脂平板,浓缩鸡白痢沙门氏菌至1010CFU/mL,接种1010CFU细菌于配制好的琼脂平版上,连续培养72h。结果表明,琼脂平板上没有细菌生长的最低药物浓度即厌氧条件下喹赛多对cvcc528的最小防突变浓度(MPC)为40μg/mL。喹赛多对回肠内容物中沙门氏菌的杀菌曲线绘制：灌胃给药后不同时间点采集的回肠内容物样品经过滤除菌后,接种等量沙门氏菌cvcc528,置于厌氧培养箱培养,在0、1、2、4、8、12、24h,采用倾倒法进行菌落计数,得到各个时间点活菌数后绘制杀菌曲线。结果表明,高浓度组(>10μg/mL)在体外培养4h后细菌数目变化最为明显,已经检测不到细菌；低浓度组(2～10μg/mL)体外培养12h后出现细菌数目缓慢下降的现象；当药物浓度低于最低抑菌浓度(2μg/mL)时,部分细菌受到抑制,细菌的增长幅度略低于空白对照组,表明这些组药物浓度不能抑制细菌生长；试验中没有检测到细菌出现反弹生长的现象。2喹赛多在鸡肠道和血浆中的药代动力学研究实验选用100只30日龄三黄肉鸡,按体重随机分为二组,每组50只。选择一组攻毒沙门氏菌cvcc528,构建沙门氏菌腹泻模型。两组实验动物均按照30mg/kg体重灌胃给药。所有鸡灌胃给药结束后,在0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h分别取5只鸡进行定点宰杀,取其血液和回肠内容物。采用高效液相色谱法检测各时间点血浆和回肠内容物中的喹赛多浓度。结果表明：喹赛多在血浆中最高浓度为0.016μg/mL,尚未达到喹赛多的最低抑菌浓度(MIC=2μg/mL),所以不满足模型的要求。健康鸡各时间点回肠内容物中喹赛多浓度分别为：205.87、234.26、293.81、49.4、13、2.15、0.59、0.42、0.36μg/mL,患病鸡各时间点回肠内容物中喹赛多浓度分别为：57.02、110.58、157.52、53.54、17.31、3.71、2.37、0.74、0.4μg/mL经过Winnonlin软件模拟得到喹赛多在鸡回肠内的代谢参数,经单次口服灌胃后喹赛多在肠内代谢过程均符合有吸收一室模型。喹赛多在鸡的肠道内代谢较快,最高药物浓度Cmax为143.28-283.34μg/mL；达到最高浓度时间Tmax为1.08-1.32h；T1/2为0.62-0.67h；有效持续时间T>MIC为5.23-6.36h；曲线下面积AUC为379.22～691.84h·μg/mL。由健康模型和疾病模型的代谢参数可看出,喹赛多在健康鸡体内的Cmax值和AUC值与在疾病模型中的相应值存在显著差异,分析其原因可能是由于健康鸡在感染沙门氏菌后肠道菌群对喹赛多的代谢以及相关的药物代谢酶活性发生变化而导致。3喹赛多对鸡沙门氏菌cvcc528耐药风险评估向含有1、2、4、8、16、32、64μg/mL喹赛多的MH肉汤中接种等量的细菌,各瓶中细菌的浓度为109CFU/mL,厌氧培养适当时间后取100μL在含8μg/mL(4×MIC)的喹赛多琼脂平板上厌氧培养相应时间后进行活菌落计数,当菌落数在100CFU内为自然条件下产生的耐药突变菌,菌落数大于100CFU时为实验条件下产生的突变耐药菌。实验结果表明,空白组及药物浓度低于MIC(2μg/mL)组,除少部分没有产生耐药外,大部分会都出现耐药现象。产生耐药性比较密集的是在MIC(2μg/mL)至MPC(40μg/mL)范围内。但是当药物浓度接近MPC增大到32μg/mL时,接触24小时后不再有耐药菌产生。当药物浓度大于MPC(40μg/mL)时,细菌不再产生耐药性。结合MSW理论,药物浓度低于MIC时大部分沙门氏菌还是产生了耐药性,实验结果与MSW理论不太相符。说明给药剂量必须使患病部位药物浓度达到MPC才能抑制细菌产生耐药性。综上所述,根据实验测得的给鸡灌胃30mg/kg体重后回肠内容物中的药物浓度,如果采用每天给药2-3次,24小时内喹赛多药物浓度高于MPC的时间占到了40%左右,能够迅速杀灭耐药菌；理论不会产生耐药菌。每天给药一次则达到MPC值的时间较短,低浓度喹赛多与沙门氏菌接触时间较长,存在耐药菌富集的风险。4PK-PD模型的拟合与给药方案的制定喹赛多对沙门氏菌的体外抑菌实验确定了喹赛多的抗菌类型为浓度依赖型,因此,拟合模型时我们参考的PK-PD参数为半体内的AUC/MIC和Cmax/MIC。通过Sigmoid Emax模型分别拟合Cmax/MIC及AUC/MIC与抗菌疗效之间的关系。通过得到方程发现Cmax/MIC和AUC/MIC两个参数最终所得的结果相当。最终选定的PK-PD拟合方程为E=2.72-7.3*C1.63/335.931.63+C1.63,反映的是半体内AUC/MIC值与抗菌疗效之间的相互关系,当E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时,对应的C值,即半体内AUC/MIC值分别为244.02、739.66、1509.99。结合给药方程X=d×AUCexvivo/MICtested/AUCinvivo/MICtarget可计算得出最佳给药剂量X(mg/kg/d)。当临床分离菌MIC=2μg/mL,E=0、-3、-4(抑菌、杀菌、根除)时,对应的X值,即给药剂量为21.16、64.14、130.95mg/kg/d。对于不同情况,我们可以制定不同的给药方案：对于沙门氏菌病的预防用药,可按20mg/kg体重给药；治疗用药,可按65mg/kg体重给药；按130mg/kg体重给药时理论上可根除细菌,避免耐药菌的产生。考虑到农户大都采用鸡场规模化养殖,口服给药比较繁琐,因此将给药方式转换为混饲。群体给药公式为D=dxn/W,d为按体重给药量；n为每天给药次数；W为不同年龄段鸡的体重和采食量的转换比,21日龄的小鸡的W值约为120g/kg/d;D为群体混饲给药量。如果临床分离菌MIC值为2μg/mL,作为临床治疗用药,由此得到最佳群体混饲给药量为1.08g/kg饲料给药,每天饲喂两次。综上所述,本课题阐明了喹赛多对鸡沙门氏菌的抗菌特性,揭示了喹赛多在健康鸡和患沙门氏菌病鸡体内的肠道动力学特点,首次构建了喹赛多对鸡沙门氏菌的PK-PD同步模型,考虑到临床耐药突变选择风险,进一步确定了喹赛多防治鸡沙门氏菌病的临床最佳给药方案。在治疗沙门氏菌病的同时减少了耐药性的产生,为农户节约养殖成本。