研究背景近年来,中国的糖尿病患病率急剧上升,据国际糖尿病联盟2021年11月更新的数据显示:世界范围内的成年糖尿病患者人数已高达5.37亿,占全球总人口数10.5%;中国人糖尿病患病人数在2011-2021年间,从9000万增长到了1.4亿。糖尿病会导致身体症状以外的情绪障碍,其中抑郁症是较常见的一种情绪障碍,以情绪低落、快感缺乏为主要表现症状,同时可伴有活动缓慢、食欲不振和无助感等。糖尿病人群罹患抑郁症的风险相对更高,研究表明在糖尿病患者中有30%以上的概率被诊断为抑郁症;糖尿病患者的抑郁倾向较普通人高出三倍。传统医学古籍中虽未见糖尿病合并抑郁症的确切记载,但相关的临床表现在历代古籍中有散在记录。糖尿病归属于传统医学中的“消渴”。抑郁症的症状比较复杂,与祖国医学中的“百合病”、“脏躁”“郁证”等临床表现有诸多相似之处。现代研究发现,包括持续高血糖状态在内的各种应激所导致的肝脏相关的病理改变,可能与神经-内分泌-免疫网络功能变化相关,其中兴奋或抑制状态的大脑皮层以及以交感神经为主的自主神经功能等都与肝脏功能有密切联系。目前常用的治疗方法大多采用降糖联合抗抑郁的对症治疗,且存在病情容易反复、有较严重的不良反应等弊端。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是一种与神经、免疫、代谢等相关的营养因子,BDNF为神经元的存活及正常生理功能提供所必须的营养支持。BDNF及其同源受体原肌球蛋白受体激酶B（Tropomyosin receptor kinase-B,TrkB）除了在神经元的存活、分化和可塑性中发挥重要作用外,还通过影响中枢神经系统发挥调节能量和葡萄糖稳态的作用。研究表明,迷走神经刺激（Vagus nerve stimulation,VNS）可增加海马BDNF含量进而激活神经保护途径以缓解抑郁症状,同时调节糖脂代谢,改善胰岛素抵抗状态。但VNS存在易感染、呼吸困难、咽喉嘶哑等手术并发症。神经解剖学研究表明,耳穴心、肝、脾等所在的耳甲区正是体表唯一有迷走神经传入纤维存在的区域。课题组多年来关于耳穴电刺激（Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation,taVNS）的研究已经充分证实基于VNS技术和传统中医耳穴理论的taVNS对糖尿病及抑郁症治疗都有着良好的疗效。刺激迷走神经可在调节糖脂代谢的同时改善糖尿病大鼠的抑郁样行为,迷走神经的激活在抑制细胞凋亡的同时,通过迷走神经肝支提高肝脏代谢功能,但其具体生物学机制尚未明确。海马是调控情绪的重要脑区,也是调控糖脂代谢的主要脑区,而肝脏也是维持代谢和情绪调节的外周靶器官之一。由此,可以认为迷走神经通过BDNF-TrkB通路达到降糖以及抗抑郁的作用。故本研究选用高脂饲料联合腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）的糖尿病造模方法,采用美国DSI（Data sciences international）植入式生理信号遥测系统,将采集时间点精确到1次/30s,实现活体实时监测taVNS对糖尿病模型大鼠即时血糖的影响;应用TrkB受体特异性阻滞剂K252a,探讨taVNS对糖尿病模型大鼠行为学、糖脂代谢相关的生化指标、海马BDNF-TrkB通路相关蛋白以及海马神经元凋亡的影响,进一步阐释taVNS调节糖脂代谢及抗抑郁的效应机制。目的（1）观察taVNS对糖尿病模型大鼠实时血糖的影响;（2）观察taVNS对糖尿病模型大鼠行为学及糖脂代谢的影响;（3）阐明海马BDNF-TrkB通路介导的taVNS改善糖尿病模型大鼠抑郁样行为及糖脂代谢紊乱的作用机制。方法实验一taVNS对糖尿病模型大鼠实时血糖的影响将12只Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为空白组（Control,C组）、模型组（Model,M组）,和耳穴电刺激组（taVNS,T组）。高脂饲料喂养4w后,T组大鼠采用高脂饲料联合腹腔注射35mg/kg 1%STZ（0.1mol/L,pH=4.4柠檬酸缓冲液溶解）使大鼠处于持续高血糖状态,以空腹血糖值（Fasting blood-glucose,FBG）≥16.7mmol/L 作为评定造模是否成功的标准。其余 C 组大鼠给予正常饮食,各组大鼠保证饮食充足和正常昼夜交替。C组、T组:造模成功后开始在吸入异氟烷条件下给予taVNS干预。在2%异氟烷吸入麻醉下,采用韩氏电针仪,连接两个正负极自吸附导电磁铁,无创固定于大鼠的耳甲内外两侧,选用的电刺激部位为耳迷走神经的分布区域,刺激参数选用疏密波2/15 Hz,2mA,每次30min,每天1次,持续7天。应用美国DSI植入式生理信号遥测系统,在大鼠清醒自由活动的状态下,持续连续实时监测各组大鼠在不同时间点的血糖和体温的变化情况。实验二taVNS对糖尿病模型大鼠抑郁样行为及糖脂代谢的影响48只体质量为200±20g的SPF级健康成年雄性SD大鼠,适应性喂养一周后,随机分为C组,M组,T组和TrkB受体特异性阻断剂对照组（K252a,K组）,每组12只。造模方法及标准同实验一。每两周检测旷场实验得分、强迫游泳不动时间以评价大鼠抑郁样行为。从第6周开始对T组、K组大鼠连续干预21天,C组和M组不予taVNS干预,K组:在每次刺激前30min腹腔注射TrkB特异性阻断剂K252a（25μg/kg）。每周测量大鼠体质量、FBG变化,每两周进行旷场实验和强迫游泳实验,分别在各组大鼠造模前和造模后尾静脉取血检测血清胰岛素水平;实验结束后处死大鼠,腹主动脉取血,应用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）技术检测各组大鼠甘油三酯（Triglyceride,TG）、血清总胆固醇（Serum total cholesterol,TC）和低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL-C）和糖化血红蛋白（Glycosylated hemoglobin,GHbA1C）的变化;通过苏木精—伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察胰腺组织的形态学变化。实验三BDNF-TrkB通路介导taVNS改善糖尿病模型大鼠糖脂代谢及抑郁样行为的效应机制通过蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）技术检测各组大鼠海马脑区中BDNF、TrkB、PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达;通过HE染色观察海马CA1区神经元的形态学变化;通过Tunel方法检测大鼠海马CA1区神经元凋亡情况。结果实验一taVNS对糖尿病模型大鼠实时血糖的影响（1）血糖昼夜变化:与C组比较,M组大鼠血糖昼夜波动较大（P＜0.05）;经过taVNS干预后,与M组比较,T组大鼠昼夜血糖波动趋近于C组。（2）体温昼夜变化:与C组相比,M组大鼠体温变化波动显著增大（P＜0.05）;经taVNS干预后,与M组相比,T组大鼠体温变化波动显著减小（P＜0.05）。（3）各组大鼠体温与血糖的相关性分析:各组大鼠体温与血糖呈正相关,即体温随血糖的升高呈上升趋势。（4）taVNS对大鼠实时血糖的影响:taVNS使各组大鼠随机血糖呈上升趋势,C组大鼠在干预停止后,随机血糖在60min内下降至平稳,与干预前无统计学差异（P＞0.05）。M组大鼠第1天、第4天干预结束后25min随机血糖下降到最低值,在第7天干预结束后40min随机血糖下降到最低值,随后血糖呈上升趋势,在干预结束后60min随机血糖趋于平稳,与干预前相比随机血糖显著降低（P＜0.05）。与第1天的初始血糖相比,第7天的随机血糖值显著降低（P＜0.05）。持续7天刺激后,与随机血糖的基线比较,C组大鼠随机血糖无统计学差异（P＞0.05）,M组大鼠随机血糖显著降低（P＜0.01）。实验二taVNS对糖尿病模型大鼠抑郁样行为及糖脂代谢的影响（1）一般情况:C组大鼠行动敏捷,对外界环境反应敏捷,好动;形体匀称,体质量呈持续增加趋势,皮毛健康光泽度良好,二便正常,角膜清透未见异常。M组大鼠可见明显的多食、多饮、多尿,C组大鼠比较,体质量的增长速度明显降低,即糖尿病典型的“三多一少”症状。随着持续的高血糖状态,M组大鼠的消瘦情况逐渐明显,并伴随着活动减少,精神萎靡以及对外界环境变化反应迟钝,毛色晦暗、发黄并可见大幅度脱落,采血后易发生烂尾现象,部分大鼠出现大便稀溏。T组大鼠体质量增长速度缓慢或保持稳定,毛发脱落情况逐渐缓解,摄食量、饮水量及尿量均减少,大便恢复正常。K组与M组大鼠比较变化不大。（2）体质量:各组大鼠造模前体质量无统计学差异（P＞0.05）;与C组大鼠比较,在第3w高脂饲料喂养的大鼠体质量出现统计学差异（P＜0.01）。在第7w体质量显著下降（P＜0.05）。经过taVNS干预后,与M组相比,T组大鼠的体质量下降得到缓解,taVNS的作用可以被阻断剂阻断。（3）旷场实验:造模前各组大鼠旷场实验水平运动得分和垂直运动得分无统计学差异（P＞0.05）,组间具有可比性;在第4w开始,与C组比较,M组大鼠旷场实验水平运动得分和垂直运动得分明显降低（P＜0.001）,表明M组大鼠探索能力降低,出现焦虑抑郁样行为;taVNS干预第3w,与M组相比,T组大鼠水平、垂直运动得分明显增加（P＜0.01）;与T组比较,K组大鼠水平运动得分和垂直运动得分明显降低（P＜0.01）。（4）强迫游泳实验:造模前各组大鼠在强迫游泳实验中静止不动时间无统计学差异（P＞0.05）,即组间具有可比性;在第4w开始,与C组比较,M组、T组大鼠强迫游泳静止不动时间明显增加（P＜0.01）,表明M组大鼠出现抑郁样行为;taVNS干预3w后,与M组相比,T组强迫游泳静止不动时间明显减少（P＜0.01）;与T组比较,K组大鼠强迫游泳静止不动时间明显增加（P＜0.01）。（5）空腹血糖:与C组相比,M组大鼠FBG从第5w开始显著升高（P＜0.001）;taVNS干预后,与M组比较,T组血糖在第7w显著降低（P＜0.001）。与T组比较,K组大鼠血糖显著升高（P＜0.01）。（6）血清INS、TG、TC和LDL-C含量:造模前各组大鼠在血清INS、TG、TC和LDL-C含量无统计学差异（P＞0.05）,即组间具有可比性;在第4w开始,与C组比较,M组、T组大鼠血清INS含量明显增加（P＜0.001）,此实验表明M组大鼠出现胰岛素抵抗;taVNS干预3w后,与M组相比,T组血清INS、TG、TC和LDL-C含量显著下降（P＜0.001）;与T组相比,K组血清INS、TG、TC和LDL-C含量显著上升（P＜0.001）。（7）GHbA1C:与C组比较,M组大鼠GHbA1C水平明显升高（P＜0.01）;taVNS干预3w后,与M组相比,T组GHbA1C水平显著下降（P＜0.01）。与T组比较,K组大鼠GHbAlC显著升高（P＜0.05）。（8）胰腺形态学改变:C组大鼠的胰腺细胞团形状主要以规则的圆形和椭圆形的细胞团为主,结构完整且边缘清晰可见,胰岛β细胞数量丰富、形状规则均匀、体态饱满充盈、结构排列紧密;M组大鼠胰腺组织细胞团形态异常,整体结构欠规整、胰岛细胞的边缘不清,胰岛内细胞质染色变浅或以空泡样状态呈现;与M组大鼠比较,T组大鼠胰腺组织形态组织结构均有改善;与T组大鼠比较,K组大鼠胰腺组织形态结构未见明显改变。实验三BDNF-TrkB通路介导taVNS改善糖尿病模型大鼠糖脂代谢及抑郁样行为的效应机制（1）海马脑区BDNF、TrkB、PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达:与C组相比,M组大鼠海马BDNF-TrkB通路以及下游通路的PI3K、AKT、mTOR蛋白表达降低（P＜0.05）。与M组相比,T组大鼠BDNF-TrkB通路以及下游通路的PI3K、AKT、mTOR蛋白表达均显著升高（P＜0.01）,TrkB蛋白表达无统计学差异;与T组相比,K组大鼠的BDNF、TrkB、PI3K、AKT、mTOR蛋白显著降低（P＜0.05）。（2）海马神经元形态学改变:C组海马CA1区神经元形态规则,排列紧密有序,细胞结构层次清晰,染色质均匀,神经元间隙正常,胞核圆形或椭圆形。M组海马神经元肿胀,核固缩,胞浆染色强烈,呈空泡状结构,排列欠规则,层次紊乱,神经元间隙延长。与M组相比,T组海马空泡细胞数量明显减少,排列稍显规则。与T组比较,K组海马神经元形态欠规则,排列稍显紊乱。（3）海马CA1区神经元凋亡率:与C组比较,M组大鼠海马神经元凋亡率显著上升（P＜0.05）;与M组相比,T组大鼠海马神经元凋亡率有上升趋势,但无统计学差异（P＞0.01）;与T组比较,K组大鼠海马神经元凋亡率有上升趋势,但无统计学差异（P＞0.01）。结论（1）高血糖状态使模型大鼠昼夜血糖和体温波动增大,而taVNS可以改善糖尿病模型大鼠的生理节律紊乱,并显著降低大鼠的随机血糖。（2）高脂饮食结合腹腔注射STZ制备的糖尿病模型大鼠,可自发的出现抑郁样行为。taVNS通过调节糖尿病模型大鼠的糖脂代谢,发挥降糖作用,同时改善糖尿病大鼠的抑郁样行为。而taVNS的这些作用可被TrkB的特异性阻断剂K252a阻断。（3）糖尿病模型大鼠BDNF-TrkB通路以及下游通路的PI3K、AKT、mTOR蛋白显著降低,taVNS刺激可显著上调糖尿病模型大鼠海马脑区的BDNF、TrkB、PI3K、AKT、mTOR的蛋白表达,继而抑制海马神经元凋亡,而TrkB的特异性阻断可抑制上述效应,说明海马脑区BDNF-TrkB信号通路可能是taVNS发挥降糖及抗抑郁效应的作用机制之一。