论文部分内容阅读
目的:1研究在食管癌组织、癌旁组织、正常组织中ZIP5基因的表达情况,探索ZIP5基因在食管癌发展中可能的作用。2构建ZIP5基因稳定低表达的食管癌细胞系,为后续细胞水平实验和动物实验提供理论和实验基础。全面研究ZIP5基因在食管癌发生发展中的作用及机制,为食管癌的预防及靶向治疗提供新的理论基础。方法:1从食管癌患者手术切除部分取食管癌组织、癌旁组织、正常组织各30例,利用免疫组化实验比较ZIP5蛋白在食管癌组织、癌旁组织与正常组织中的表达差异;用Western Blot实验验证ZIP5蛋白在食管癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达差异;用实时荧光定量PCR法从mRNA水平验证ZIP5基因在食管癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达差异。2选择有特异沉默ZIP5基因效果的siRNA序列,分子克隆携带特异序列的质粒,将其克隆入慢病毒载体质粒PSD31,包装病毒,感染食管癌细胞系KYSE170,得到稳定低表达ZIP5基因的细胞系,并用实时荧光定量PCR和Western Blot来验证其沉默效果。结果:1免疫组化实验结果显示,在30例食管癌组织中,有28例ZIP5基因表达;在30例癌旁组织中,有13例ZIP5基因表达;在30例正常组织中,有3例ZIP5基因表达,其表达量分别为4.10±0.51、0.78±0.97、0.20±0.03,ZIP5基因在组织中的表达水平从高到底依次是:癌组织,癌旁组织,正常组织。Western Blot实验结果显示,ZIP5蛋白在癌组织中相对表达量为3.05±0.20;在癌旁组织中相对表达量为1.78±0.92;正常组织中相对表达量为0.52±0.29,ZIP5基因在组织中的表达水平从高到底依次是:癌组织,癌旁组织,正常组织,与免疫组化结果相同;qRT-PCR结果显示:以正常组织为标准,值为1,癌组织相对表达量为14.83±4.63,癌旁组织相对表达量为4.17±0.79,可认为ZIP5基因在组织中的表达水平从高到低依次是:癌组织,癌旁组织,正常组织,与以上结果相同。2成功将携带特异序列的质粒克隆入TA载体,通过酶切及测序验证重组质粒的正确性;成功构建PSD31-ZIP5-shRNA质粒;成功包装慢病毒并构建稳定细胞系;qRT-PCR及Western Blot检测ZIP5蛋白表达下降,ZIP5基因稳定低表达的食管癌细胞系成功建立。结论:1ZIP5蛋白在食管癌组织、癌旁组织、正常组织中表达强度明显由强到弱。2ZIP5基因稳定低表达的细胞系成功建立。