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【研究背景】鼻咽癌（nasopharyngeal carcilloma,NPC）是我国南方地区高发的恶性肿瘤之一,放射治疗作为鼻咽癌的标准治疗方法已得到肿瘤学者们的共识。无论是在鼻咽癌高发的中国南方及东南亚国家或地区,还是在发病率较低的西方国家,鼻咽癌均具有相似的临床及生物学行为,由于鼻咽部解剖位置特殊,鼻咽癌有较强浸润性生长的特点,临床上常常不易早期发现,因此大多数患者确诊时已属于晚期;尽管近年来放疗设备不断更新、放疗技术日趋完善、放射物理及生物学研究不断进步和发展,使鼻咽癌单纯放疗的疗效有了很大的提高,但仍存在着较高的放疗失败率。对于放疗失败率报道不一,导致这种差别的主要原因是收治的患者的临床分期不同,但均一致认为肿瘤的局部复发和远处转移是放疗失败的主要原因。有研究指出,鼻咽癌肿瘤细胞在放疗的过程中可能存在着加速再增殖的现象,临床的研究结果也提示这种加速再增殖有可能发生在开始放射治疗后4周左右。为了探讨鼻咽癌放疗加速再增殖的机理,笔者的前辈作了大量的研究工作,通过对鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE-2细胞的一系列实验研究,证实鼻咽低分化鳞癌细胞株照射过程中（中后期）存在肿瘤细胞的加速再增殖现象,并发现照增殖活性最高时相与最低时相表达差异最显著的基因是CDC25A,其差别在2倍以上,因此笔者选择CDC25A作为开展功能研究的目的基因。笔者采用RNAi技术对目的基因CDC25A进行研究,RNAi是新近发展的一种封闭基因表达的有效方法,获得2006年诺贝尔生理学奖。它由双链RNA诱发的基因沉默,通过将双链RNA（dsRNA）导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA（siRNA）,与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象,具有特异性强、抑制效率高,可扩散性、可遗传性等特点。由于RNAi技术具有独特的作用机制和简便的技术流程,因此逐步替代反义核酸技术及基因敲除技术在基因功能研究上的地位。作为肿瘤基因治疗研究的新方法,RNAi技术得到了广泛的应用和迅速的发展,但在鼻咽癌的放疗和加速再增殖机理研究领域中,目前尚无该技术的报道。【研究目的】采用RNAi技术沉默鼻咽癌细胞株（CNE-2）CDC25A基因,了解沉默CDC25A基因后鼻咽癌细胞株（CNE-2）在照射中的生长增殖变化情况,初步探讨CDC25A表达对鼻咽癌细胞株（CNE-2）照射的影响,以进一步了解鼻咽癌细胞株（CNE-2）照射中加速再增殖发生的分子生物学机制,从而为鼻咽癌非常规分割放射治疗提供理论依据。【研究方法】1.采用RNAi技术构建抑制CDC25A表达的细胞株:通过构建siRNA表达载体,将构建的Psilence4.1-CDC25A载体以阳离子脂质体法转染入CNE-2中,经过G418毒性实验筛选、阳性克隆有限稀释法筛选等方法,培养出能抑制CDC25A表达的CNE-2细胞。2.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白印迹法（western blot）在mRNA水平和蛋白水平上验证所筛选出细胞株的干扰效果,并检测在照射下细胞株CDC25A的表达变化。3.四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）及流式细胞术（FAM）检测在60Co-γ线,2Gy/d,连续5天的照射下细胞株的生长增殖变化情况及细胞周期各时相的分布。【研究结果】1.构建了载体Psilence4.1-CDC25A,经测序鉴定符合要求;经转染、筛选、培养,培育出抑制CDC25A表达的CNE-2细胞株4株,对照细胞株3株。2.RT-PCR检测Psilence4.1-CDC25A细胞的抑制率为49.6%,WesternBlot法检测其抑制率为52.5%;RT-PCR、Western Blot法检测结果表明,Psilence4.1-CDC25A细胞在照射第1、3、5天的CDC25A的表达较对照株psilence4.1-Control细胞低。3.MTT法检测表明,psilence4.1-CDC25A细胞的生长存活分数曲线表明,psilence4.1-CDC25A细胞在照射第1、2、3、4、5天的存活分数分别为128%、110%、127%、138%、149%,其中第5天的存活分数最高。流式细胞术检测表明,psilence4.1-CDC25A细胞在照射第5天,SPF及PI为最高值,对照株psilence4.1-Control细胞在照射第3天SPF值最高,在照射第4天PI值最高;两者相比较,Psilence4.1-CDC25A细胞的生长增殖有延迟的趋势。【研究结论】1.成功培育出抑制CDC25A表达的CNE-2细胞株,命名为Psilence4.1-CDC25A细胞,对照株命名为psilence4.1-Control细胞。2.抑制CDC25A表达后的Psilence4.1-CDC25A细胞无论是在未照射条件下还是在照射条件下,CDC25A的表达都下调,说明对CDC25A干扰的有效性。3.Psilence4.1-CDC25A细胞在照射下的生长增殖趋势发生了改变,生长增殖趋势变缓,生长增殖高峰延迟,说明抑制CDC25A表达后,鼻咽癌照射加速再增殖现象改变,但尚不能推断其加速再增殖现象已消失。这将为临床鼻咽癌放射治疗的非常规分割照射提供更夯实的实验依据。