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当饲用酶被畜禽食用后,胃是它进入的第一个停留时间较长的消化器官。然而饲用酶在胃中将面临两大危害:酸解作用和酶解作用。因此,提高饲用酶在消化道环境中对胃蛋白酶的耐受性,对其功能的发挥颇为重要。本实验室在前期的研究中提出了基于影响酶促反应过渡态复合物形成和分子结构评价的理性分子改良策略,成功获得了一个具有胃蛋白酶抗性提高的米曲霉α-淀粉酶突变体。基于该理性分子改良是否具有普适性,另外,由于蛋白糖基化程度的不确定性,那么基于无糖基化结构的分子设计,是否对有糖基化蛋白的胃蛋白酶抗性改造依然有效。为此,本研究选择出一个糖基化的纤维素酶—来源于Thermonospora fusca的纤维素酶E4作为研究对象,运用前期提出的分子设计策略,对纤维素酶E4进行胃蛋白酶抗性的分子设计,所得突变体和野生型分别在大肠杆菌和毕赤酵母中表达,然后分析比较突变体和野生型糖基化前后的胃蛋白酶抗性。来进一步探索和完善该理性设计策略。结果:（1）基于影响酶促反应过渡态复合物形成和分子结构评价设计出胃蛋白酶抗性较好的候选突变体E4L691C/L800R。（2）原核表达并纯化无糖基化的突变体和野生型蛋白,经模拟胃液处理一小时后,E4WT的半衰期为1min,而E4L691C/L900R的半衰期可持续到60min。（3）真核毕赤酵母表达并纯化得到糖基化的E4WT和E4L691C/L900R蛋白,经模拟胃液处理一小时后,E4WT的半衰期为1min,E4L691C/L800R的半衰期大于60min。（4）对E4WT和E4L691C/L800R糖基化前后的酶学性质测定发现,未糖基化的E4WT和E4L691C/L800R的Km值为0.01499mg/mL,0.01488mg/mL;Kcat值为25.17 s-1,23.36 s-1。糖基化的E4WT和E4L691C/L800R的Km值为0.04099mg/mL,0.04026mg/mL;Kcat值为30.08 s-1,26.13 s-1。糖基化前后两者的最适温度均为60℃左右,最适pH均为5.0-6.0;各酶在pH为4.0-8.0缓冲液中或温度为30℃-40℃下存放一定时间,均能保持80%以上的酶活。结论:（1）通过理性设计得到纤维素酶E4L691C/L800R,其糖基化前后胃蛋白酶抗性明显提高。半衰期较野生型提高了59min。（2）基于影响酶促反应过渡态复合物形成和分子结构评价的理性设计策略适用于纤维素酶E4的胃蛋白酶抗性改良。（3）利用无糖链的纤维素酶E4蛋白三级结构进行分子设计对其糖基化蛋白的胃蛋白酶抗性改良依然适用。（4）纤维素酶E4L691C/L800R与E4WT的最适温度,最适pH,温度稳定性和pH稳定性等酶学性质基本一致。（5）糖基化会减弱E4WT,E4L691C/L800R与底物的亲和力,但不一定会降低其将底物变成产物的能力。