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油茶是我国南方最重要的木本食用油料树种,属于后期自交不亲和性树种,因此,在种植主栽品种时需要配置相应的授粉品种。为解析油茶后期自交不亲和的分子机理,本课题组构建了油茶自交和异交雌蕊的组学数据库,并在前期的组学研究中发现促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）与自交不亲和性密切相关。为深入探讨CoMAPKs基因对油茶自交不亲和性的影响,以油茶主栽品种‘华硕’和‘华金’为试验材料,开展了油茶CoMAPKs基因的克隆、生物信息学分析、表达模式、原核表达、亚细胞定位、过表达以及MAPKs抑制剂apigenin对油茶花粉离体培养的研究。主要的研究结果如下:1.MAPKs抑制剂对油茶花粉离体培养的抑制作用。采用不同浓度的MAPKs抑制剂处理油茶‘华硕’花粉,经离体培养后观察。结果显示,随着MAPKs抑制剂浓度的增加,花粉萌发率及花粉管长度的抑制效果越明显。2.油茶CoMAPKs基因的克隆及生物信息学分析。以油茶主栽品种‘华硕’为试验材料,通过RT-RCR的方法克隆了 8个油茶CoMAPKs基因。其中,MAPKs类5个,MAPKKs 类 2 个和 MAPKKKs 类 1 个,分别命名为:CoMPK1、CoMPK2、CoMPK 3、CoMPK6、CoMPK9、CoMKK3、CoMKK5 和 CoMEKK1。油茶 CoMAPKs基因的全长 CDS 序列长度分别为:1119 bp、1119 bp、1098 bp、1197 bp、1764 bp、1554 bp、1093 bp和1737 bp;相应蛋白质编码的氨基酸数量分别为:372 aa、371 aa、365 aa、398 aa、587 aa、518 aa、363 aa 和 578 aa。油茶 CoMAPKs 与茶树（Came llia sinensis）CsMAPKs的氨基酸序列具有较高的相似性,达到98.07%～100%。系统进化树分析得知,CoMPK1、CoMPK2、CoMPK3、CoMPK6、CoMPK9、CoMKK3、CoMKK5 和 CoMEKK1 分别与 AtMPK1 和 AtMPK2、AtMPK3、AtMPK6、AtMPK15和AtMPK18、AtMKK3、AtMKK4和AtMKK5和AtMEKK1蛋白的亲缘关系最近。保守结构域分析得知,油茶CoMAPKs类蛋白均含有11个保守结构域（Ⅰ～Ⅺ）,在Ⅶ和Ⅷ保守结构域之间含有TxY基序,CoMAPKKs和CoMAPKKKs类蛋白均有相应的保守结构域,与MAPKs信号转导途径的结构特点一致。3.油茶CoMAPKs基因的表达模式。利用qPCR技术对油茶CoMAPKs基因在不同部位、不同处理下不同时间段的花柱和子房的表达模式进行了分析。其中,在不同部位中,CoMPK1、CoMPK6、CoMPK9和CoMKK5基因在花粉中的相对表达量最高,CoMPK2基因在子房和花粉中的相对表达量最高,CoMPK3、CoMKK5和CoMEKK1基因在子房中的相对表达量最高。在花柱和子房中,CoMPK6、CoMPK9和CoMEKKK 1基因在自交24 h花柱中的相对表达量明显高于异交和未授粉。CoMPK9基因在自交48 h子房中的相对表达量极显著高于异交和未授粉,CoMKK5基因在异交2 h和24 h子房中的相对表达量极显著高于自交和未授粉。4.油茶CoMAPKs基因的原核表达。利用同源重组的原理构建了这8个基因的原核表达载体pCold-CoMAPKs,分别转化至E.coli（DE3）感受态细胞。经SDS-PA GE电泳分析,重组载体pCold-CoMAPKs在IPTG不同终浓度下都诱导出了一条相应的目的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。5.油茶CoMAPKs基因的亚细胞定位。构建了这8个基因的亚细胞定位载体pC AMIB1300-CoMAPKs,利用瞬时表达的方法转化至本式烟草叶片中。观察结果显示:CoMPK1、CoMPK3、CoMKK5 和 CoMEKK1 蛋白在叶绿体中表达,CoMPK2、CoM PK6、CoMPK9和CoMKK3蛋白在内质网中表达。6.油茶CoMAPKs基因对拟南芥的遗传转化。构建了这8个基因的过表达载体pCAMIB1304-CoMAPKs。通过花粉管通道法转化至野生型拟南芥中,获得了这8个基因的T3代纯合子。这8个转基因拟南芥植株的表型无明显差异。采集野生型拟南芥和T3代转基因CoMPK6、CoMPK9、CoMKK5和CoMEKK1拟南芥植株的花蕾作为试验材料,在波长450 nm的多功能酶标仪下进行植物内源激素(乙烯合成酶（ACCS）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）和吲哚乙酸（IAA）的测定。分析发现,转基因CoMPK6拟南芥植株的SA含量低于野生型拟南芥,转基因CoMPK9拟南芥植株的SA含量高于野生型拟南芥,转基因CoMPK6拟南芥植株的ABA含量高于野生型拟南芥,转基因CoMPK6、CoMPK9、CoMKK5和CoMEKK1拟南芥植株的ACCS含量显著高于野生型拟南芥。