糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）属于一种全身性的微血管并发症,是严重的肾脏疾病,已经发展成为全球性严重的公共卫生问题。有研究报道称,糖尿病病程在10年以上的患者有20%会发生DN。早期DN的临床症状表现为尿微量白蛋白以及基底膜增厚,较难发现且病变难以逆转,缺乏有效的治疗策略。因此,早期诊断,及时防治至关重要。足细胞和系膜细胞（Glomerular mesangial cells,GMCs）是肾脏的固有细胞,其异常的功能性变化对DN的发生发展产生重要影响。在疾病状态下,GMCs会出现异常的增殖,进而导致细胞外基质沉积,肾小球基底膜增厚等病理变化。足细胞作为调节肾小球滤过能力的重要细胞,其结构的完整以及数量的恒定可以维持肾脏的正常滤过能力,对肾小球的完整性发挥关键作用。DN的生理病理机制十分复杂,涉及遗传信息的改变、氧化应激反应、炎症因子的生成及糖脂代谢紊乱等。在糖代谢异常中,葡萄糖转运蛋白的表达和转位障碍成为一大热点话题。在高糖环境下,细胞代谢的第一道限速步骤就是葡萄糖摄取。葡萄糖又是一种极性、亲水性的分子,因此需要载体蛋白跨膜转运进入细胞,糖转运体（Glucose transport,GLUT）的调节就是其中的关键环节。小檗碱（Berberine,BBR）可以从天然植物黄连根茎中提取,具有抗氧化应激、抗炎、降低血糖的作用。因此,研究BBR影响糖转运,对肾脏细胞异常变化进行调控的机制,可以更好地为DN的临床治疗提供新的方向和靶点。目的:结合体内和体外实验,研究BBR对DN小鼠肾脏功能指标,形态学变化和肾小球超微结构的影响,以及对肾脏细胞异常变化的调节作用,探究BBR对DN小鼠肾脏保护作用的具体机制。方法:体内实验采用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,50 mg/kg）连续注射五天,并联合高脂饲料喂养的方法建立糖尿病小鼠模型。3 d,7 d测定小鼠的空腹血糖值（Fasting blood glucose,FBG）,将FBG?16.7 mmol/L的小鼠纳入实验组,此后继续高脂饲料喂养10周,以制备DN模型。实验分为高脂模型组（DN）,BBR中剂量组（90 mg/kg）,BBR高剂量组（180 mg/kg）,阳性药对照组（Metformin,200mg/kg）,另设置正常对照组。药物治疗组每日一次,灌胃给药,正常对照组和高脂模型组均灌胃给予羧甲基纤维素钠,作为对照。模型组及药物治疗组继续给予高脂饲料喂养,正常对照组给予普通饲料喂养。10周之后,对小鼠肾功能参数进行检测,测定小鼠的血清氮（blood urea nitrogen,BUN）、尿肌酐（urine creatinine,UCr）和尿总蛋白（total urine protein,TUP）;并采用HE,PAS染色法观察小鼠肾脏的病理学变化,透射电子显微镜法观察小鼠肾小球基底膜的超微结构变化,Western blot法检测PI3K/AKT信号通路的变化情况,并采用免疫组化分析小鼠肾脏GLUT1和GLUT4的表达水平。体外实验分为两部分,首先以GMCs作为研究对象,MTT和Ed U法检测不同时间不同浓度BBR对正常培养基以及高糖刺激下GMCs异常增殖的影响;流式细胞仪检测BBR对GMCs周期异常分布的影响;Western blot和RT-q PCR检测BBR对PI3K/AKT/AS160/GLUT4相关分子的表达情况,2-NBDG检测BBR对高糖刺激下GMCs糖摄取的情况。其次以足细胞作为研究对象,Western blot法检测高糖刺激下足细胞损伤蛋白desmin以及标志蛋白podocin的表达情况,同时使用流式细胞仪检测高糖刺激不同时间下足细胞的凋亡水平,进而确定足细胞损伤的时间点。2-NBDG法观察BBR对高糖诱导下足细胞内的糖摄取;Western blot法筛选足细胞内GLUT亚型的表达情况及BBR对高糖诱导下足细胞PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白和凋亡通路caspase8/caspase3的变化情况;同时,采用流式细胞仪和Hoechst染色法检测BBR对高糖情况下足细胞凋亡水平的影响。结果:第一部分:小檗碱对糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用1,生化指标显示,DN组小鼠的BUN,UCr和TUP的值较正常对照组明显升高（P<0.001）,BBR（90,180 mg/kg）与二甲双胍组均可以不同程度的改善此现象（P<0.001）。HE和PAS的组织病理学结果均提示,与正常组相比,DN组小鼠出现肾小球硬化,糖原沉积,细胞外基质堆积以及基底膜明显增厚。给予不同剂量BBR（90,180 mg/kg）后,可明显改善DN小鼠肾脏的病理变化以及肾小球基底膜增厚现象,与二甲双胍疗效相似。2,免疫组化及Western blot结果显示,BBR（90,180 mg/kg）可以明显减少DN小鼠肾脏组织内GLUT1和GLUT4的表达水平（P<0.05）,其机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。第二部分:小檗碱对高糖诱导下GMCs细胞周期的分子机制研究1,MTT和台盼蓝染色结果显示,与NC组相比,在高糖中培养24 h后,GMCs发生异常增殖（P<0.001）;给予BBR治疗后可以不同程度地改善异常现象（P<0.05）。2,Ed U结果显示,随着高糖刺激时间的增加,GMCs在20 h开始发生异常增殖（P<0.05）,且随着时间的增加,细胞的异常增殖现象越显著。3,流式细胞仪结果提示,高糖刺激下GMCs增殖周期发生变化,显著阻止GMCs进入G1期（P<0.05）,加速G1细胞进入S期（P0.05）。BBR干预治疗后,不仅能增加G1期的比例,还能减少S期的比例,且随着时间的推移,这一趋势变得更加显著（P<0.001）。4,Western blot和RT-q PCR结果显示BBR能显著抑制高糖诱导下PI3K,p-AKT,p-AS160和m-GLUT4蛋白变化（P<0.05）。同时,BBR也抑制了PI3K,AKT,AS160和GLUT4的m RNA表达情况（P<0.05）。5,2-NBDG法测量葡萄糖摄取,发现高糖显著增加了GMCs的葡萄糖摄取（P<0.001）,BBR可以明显改善这一现象。同时,BBR可以显著调节GMCs异常的细胞周期。第三部分:小檗碱对高糖诱导下足细胞凋亡和自噬的影响1,Western blot结果显示,desmin蛋白表达在高糖刺激12 h后明显上调（P<0.01）;足细胞特异性蛋白podocin的蛋白表达水平在24 h显著降低（P<0.01）。2,Ed U染色显示,随着高糖刺激时间的增加,足细胞增殖数量减少。3,流式细胞仪结果显示,足细胞在高糖刺激24 h时发生显著凋亡（P<0.01）。4,Western blot结果表明,Total-GLUT1,2,4的蛋白表达均有所升高,但是没有显著性（P（29）0.05）;m-GLUT1,2的蛋白表达情况明显增加（P<0.05）。5,2-NBDG结果表明BBR可以降低高糖情况下糖摄取的异常情况。6,Western blot结果提示,BBR可以抑制高糖情况下PI3K/AKT/m TOR及caspase8/caspase3信号通路相关蛋白的表达（P<0.05）。7,流式细胞仪及Hoechst染色结果表明,BBR可以减少高糖刺激下足细胞的凋亡情况（P<0.05）。结论:1,BBR对DN小鼠的肾脏保护作用可能与抑制PI3K/AKT信号通路,改善糖原沉积有关。2,体外研究显示,BBR抑制GLUT4的转运以及GMCs细胞周期分布可能与PI3K/AKT/AS160/GLUT4通路有关。3,BBR可以通过PI3K/AKT/m TOR和caspase8/caspase3信号通路调节高糖情况下足细胞的自噬与凋亡,缓解足细胞数量减少的现象,可能涉及糖转运现象。