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烟草蚀斑病毒蛋白酶具有较高作用序列专一性,主要用于切除融合标签,但是野生型蛋白酶在大肠杆菌中表达的可溶性不高,为此,本文构建了1种氨基酸突变体和15种含有1个或多个精氨酸同义密码子突变体,分析并比较了不同突变体蛋白的重组表达、部分突变的酶活性和专一性,获得以下结果：1.构建了双突变体(L56V/S135G),表达的重组蛋白N端含有组氨酸标签,C端分别含有组氨酸标签,GFP报告蛋白,或S-tag,分别用于检测蛋白的水溶性表达和利用Ni-NTA亲和层析快速纯化蛋白。2.通过流式细胞仪检测双突变体的水溶性表达水平低于三突变体(T17S/N68D/I77V)和五突变体(T17S/L56V/N68D/I77V/S135G),但高于野生型蛋白。提高诱导温度后,和其它形式蛋白相比,二突变体蛋白酶活性不受影响,而其它突变体和野生型蛋白酶活降低。3.纯化了野生型和突变体蛋白,分析双突变体蛋白酶的性质,它的催化常数高于野生型蛋白酶,但低于三突变体和五突变体,热稳定性仅低于五突变体,在2M的尿素和盐酸胍存在下,蛋白酶活性保持最高。4.在1mM IPTG和37℃诱导后,大肠杆菌所有构建的蛋白酶表达几乎为包涵体,但是共表达分子伴侣后,二突变体恢复的表达水平最高。5.在五突变体基础上,构建了15个精氨酸同义密码子突变体,用大肠杆菌优先表达的密码子取代编码蛋白酶的稀有密码子,同时构建了C端含有GFP,以及部分突变体含C端S-tag的融合表达载体。6.利用SDS-PAGE、蛋白印迹和GFP荧光强度检测蛋白在上清和沉淀中表达,重组突变体显示不同的差异性表达,同义突变对蛋白的可溶性表达和蛋白折叠都有影响。7.利用大肠杆菌RosettaTM(DE3)菌株提高内源稀有tRNA表达水平,能提高个别突变体可溶性表达,但同时也降低一些突变体的水溶性表达。利用C-端的融合S-tag检测到一些突变体蛋白表达为包涵体是由于蛋白翻译速度增加所致。8.纯化了部分突变体蛋白,电泳显示蛋白纯度较高,但提高内源稀有tRNA会降低纯化的蛋白酶活性,同时降低个别蛋白酶同义突变体的识别序列专一性。从同义突变文库中初步筛选出比野生型表达量和活性都提高的突变体。综上所述,本研究证明通过氨基酸突变获得的蛋白酶具备很好的水溶性、活性和稳定性仍面临巨大挑战,而同义突变和提高内源稀有tRNA水平对蛋白酶的可溶性表达、活性和专一性具有不同影响,通过扩大同义突变体文库量,有望筛选出改善水溶性、活性和稳定性的突变体。