氧化剂作为线粒体电子转移、炎症反应、有氧代谢过程的副产品，在体内不断产生，尽管机体的酶促和非酶促抗氧化防御体系可保护细胞免受氧化损伤，但仍有一些氧化剂逃避了机体的防御机制而造成大分子损伤，包括蛋白质、脂质、DNA、RNA。DNA的氧化损伤与老化，年龄相关的退行性疾病以及肿瘤的发生有着密切关系。 oh~8dG是活性氧导致的一个DNA碱基修饰产物，在DNA复制过程中，oh~8dG可引起G：C→T：A的颠换，从而引起突变。1986年Floyd等利用高效液相色谱电化学法测定了oh~8dG，这使得测定细胞DNA中的oh~8dG成为可能。oh~8dG作为DNA氧化损伤重要的生物标记物，受到广泛重视。 本研究以BSA-oh~8dG偶联物免疫BALB/C小鼠，用杂交瘤技术制备抗oh~8dG的单克隆抗体，通过酶标记技术检测oh~8dG在组织和细胞中的表达，建立一种快速、敏感、特异而简便的oh~8dG检测方法，探讨oh~8dG在疾病的发生和发展过程中所起的作用。 1．BSA-oh~8dG偶联物的制备：oh~8dG单体和BSA按1：4的比例混匀，加入碳二亚胺，避光，4℃搅拌过夜，用生理盐水透析平衡，浓缩至1ml体积，加50％甘油-20℃保存，即制成BSA-oh~8dG偶联物，BSA-G按同样方法制备。 2．抗oh~8dG单克隆抗体的制备：首次免疫，将BSA-oh~8dG以弗氏完全佐剂乳化，第2、3次免疫以弗氏不完全佐剂乳化，背部皮内多点注射，每周1次，每次0.2ml(含偶联物60μg)，1月后加强免疫1次，4天后取脾细胞与SP2/0细胞在50％聚乙二醇作用下融合，经HAT选择性培养。2周后用ELISA间接法筛 浙江大学硕士研兜生论文选阳性杂交瘤，选择抗BSA七h勺G阳性而抗BSA－G、BSA阴性的杂交瘤细胞，并予以有限稀释克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为 100％。杂交瘤细胞接种经液体石蜡预处理过的BALB／C小鼠腹腔，两周后收集腹水，离心后取上清，－20C保存。ELISA测定腹水效价为 1：16384，Western blot证实该单抗有较好的特异性，竞争性ELISA测定单抗的交叉反应率＜10％。 3 胃粘膜组织。h勺G测定：以单克隆抗体作免疫组化检测。h勺G在慢性浅表性胃炎组织中的表达，免疫组化结果显示，20例Hp阳性的慢性浅表性胃炎组织中有 11例为阳性表达，阳性率为 55％；20例 Hp阴性的慢性饯表性胃炎组织中洲、G的阳性表达率为 5O，Hp阳性和 Hp阴性胃粘膜组织之问的讪勺G表达水平有显著性差异。 4 HL七0细胞中ohsdG的检测：将生长良好的HL七0细胞调整至50Xm’偷l，分成4组，其中3组加入H。O。，使之终浓度为4mmow，另外一组作对照，分别于4h、6h、gb取细胞涂片（载玻片预先用多聚赖氨酸处理），镜下检查细胞密度 以排列较密但不重叠为宜，待涂片略于后用冷丙酮固定15min，取出自然干燥后，进行免疫细胞化学检测。结果显示，在正常的 HL七0细胞中，加勺G表达最低，HL七0细胞经过氧化氢处理6h，Oh勺G表达最高，不同阶段的加勺G表达水平有 显著性差异（Radii分析，P＜005）。 5 抗 Oh勺G单克隆抗体酶联免疫检测法的建立：以不同浓度的加勺G标准 品作为检测标本，绘制标准曲线，建立了检测。h‘dG的竞争性ELISA。结果表 明，该方法特异、敏感门0n旮ml入重复性好傈异系数＜10％人 结论： 1．制备的抗汕勺G的单克隆抗体能特异识别讪勺G。 2 Hp感染可使胃粘膜中的。h勺G水平升高，并且阳性表达主要在胞浆， 。h勺G作为一突变剂，可能在 Hp感染引起的胃癌中起着重要作用。 3、HL七0经外源性过氧化氢作用后，。h勺G表达水平增高，不同阶段的 。h‘dG表达水平有显著性差异。 4 竟争性ELISA具有灵敏度高、特异性强的特点，可望成为临床检测。hsdG 的试剂盒。