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拟南芥的CPA1蛋白家族(monovalent cation:proton antiporter-1)有8个成员,有的已经被证明在拟南芥的非生物胁迫耐受反应中起重要作用。AtNHX4(拟南芥Na+/H+antiporter4)是CPA1家族的成员,与AtNHX1有68%的同源性,所以预测它们可能有相似的功能,但是对AtNHX4的生物学功能还没有报道。本论文对AtNHX4的亚细胞定位及生物学功能做了较详细的研究。
RT-PCR、real time quantitative PCR和Promoter AtNHX4∷GUS转基因拟南芥的GUS染色结果显示AtNHX4的表达在种子萌发后前4天及成熟植株的果荚中非常弱,在其余组织有较强的表达,并受到多种非生物胁迫和ABA的调控。通过将两个融合蛋白CFP-AtNHX4与δ-TIP-YFP在烟草叶肉细胞原生质体中的共定位及AtNHX4-GFP在酵母细胞中的表达,我们认为AtNHX4是定位于液泡膜的蛋白。在高浓度NaCl处理时,nhx4突变体植株的生长情况明显好于野生型植株,而且其地上部分相对于野生型植株积累了较少的Na+和较多的K+,说明AtNHX4基因的缺失增强了植物的耐盐性。过量表达AtNHX4的野生型拟南芥则表现出对NaCl处理更敏感的表型。我们在大肠杆菌BL21菌株中分别表达了AtNHX4的全长蛋白和缺失C-末端亲水结构域的突变型蛋白,在没有NaCl的情况下,两者与对照菌株(转化空载体)的生长没有区别,但在高浓度NaCl条件下,两者的生长受到明显抑制,而且后者受到的抑制更严重,说明AtNHX4有Na+的转运活性,而且C末端对其功能起重要作用。另外,酵母双杂实验显示AtNHX4的C末端与AtCaM15有相互作用,进一步证明AtNHX4可能通过其C末端亲水结构域与AtCaM15的相互作用来调控其活性。综合实验结果及软件分析的结果,AtNHX4的功能可能是将液泡中的Na+运输到细胞质中,调节细胞中的Na+均衡。
通过基因序列分析,我们发现在AtNHX4的3-UTR序列中有一个可能的microRNA398(miR398)的结合位点,与miR398有4个碱基的不匹配,这与其他植物中已经证明的microRNA结合位点有所不同。拟南芥中有3个MIR398基因,实验发现它们有着各自特异的表达模式,而且AtNHX4的3-UTR序列能够影响转基因植物中GUS染色的模式。分别过量表达3个MIR398基因都降低了转基因植株的耐盐性。