论文部分内容阅读
壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基转化而来的一种阳离子多糖,具有良好的生物降解性和生物相容性,可与带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米级颗粒,可使DNA免受核酸酶的降解,作为一种具有潜力的基因载体材料,日益引起研究者广泛的关注。壳聚糖作为基因载体的主要缺陷是转基因效率比较低,所以研究者们试图通过修饰以增加壳聚糖的转基因效率。我们实验室的前期工作显示,采用精氨酸和十六烷基修饰壳聚糖,可以明显改善其转基因效率。但修饰后的壳聚糖和DNA形成的纳米粒子对细胞的影响如何,目前还没有相关研究报道。本研究选用壳聚糖基因纳米粒子(Chitosan-DNA nanoparticles,CNP)、精氨酸化壳聚糖基因纳米粒子(Arginine modified chitosan-DNA nanoparticles,ANP)和十六烷基化壳聚糖基因纳米粒子(Hexadecylene modified chitosan-DNA nanoparticles,HNP),并就其对L02细胞功能的影响进行了初步研究。研究内容主要分为两个部分:1.制备祛除内毒素的质粒DNA,壳聚糖及其上述两种修饰物与DNA按照N/P比4:1的比例采用复凝乳方法制备纳米粒子;采用粒度及zeta电位分析仪进行表征。结果:CNP、ANP和HNP的zeta电位分别为12.1-14.63 mV,粒径约为148.07-179.47nm。2.将上述三种材料与DNA形成的纳米粒子分别以5,10,30,50μg/ml的浓度(以DNA的含量为标准,后同)与L02细胞共孵育24h,采用MTT法进行细胞毒性评价,采用流式细胞分析技术和倒置荧光显微镜检测细胞凋亡,采用荧光分析技术检测活性氧自由基(ROS)的含量,运用Western-blot方法检测细胞色素C(CytC)的释放。结果显示,壳聚糖及其修饰物作为基因运载体系在低浓度下(低于30μg/ml)对L02细胞并未表现出明显毒性反应和引起细胞凋亡,在高浓度下(高于50μg/ml)则显示出一定的毒性作用。经修饰的壳聚糖并未增加壳聚糖的细胞毒性,说明这些修饰可能是安全的。