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γ-亚麻酸(γ-linolenicacid,GLA)是ω-6系列的多不饱和脂肪酸,它是花生四烯酸(ARA)和前列腺素(PG)、血栓素A2(TxA2)和白三烯(LT)的直接前体,作为人体必需脂肪酸参与细胞膜的组成,具有调节细胞的生理生化活性等一系列作用。已在医药和食品等领域得到了广泛的应用。利用微生物发酵法具有不受原料和气候限制、生产周期短、成本低和易于提取的优点,因此,引起了国内外研究的热点,研究主要集中在培养条件和菌种选育等方面。而目前这些研究的关注总脂肪量和GLA含量与产量的变化,但对于这些因素改变GLA含量机理的研究较少报道。由于菌体油脂中的脂肪酸是GLA合成的直接前体或中间代谢产物,其含量的变化蕴涵着GLA合成中一些关键代谢过程状况的信息。通过分析脂肪酸含量的变化,来探讨不同培养条件对GLA合成变化调控机制的研究,将为进一步明确GLA合成的调控机理提供依据及奠定基础。
利用GC测定了菌体油脂中脂肪酸的组分,其中主要为C16和C18系列脂肪酸。根据其各种脂肪酸含量和比例与不饱和脂肪酸的合成途径,确定∑C18/∑C16、G/L、(G+L)/0、IUFA,四值作为脂肪酸分析的指标值,可较好的反应GLA的合成能力,其生物化学意义如下:∑C18/∑C16表示脂肪酸碳链延长程度,G/L(亚麻酸/亚油酸)、(G+L)/O((亚麻酸+亚油酸)/油酸)分别表示△6-和△12-位的脂肪酸脱氢的作用,IUFA则表示脂肪酸的不饱和度即整体的脂肪酸脱氢的程度。
葡萄糖、铵离子、金属离子、缓冲剂、表面活性剂、溶氧和温度等因素对深黄被孢霉合成GLA的影响的结果表明:铵离子对GLA合成中脂肪酸△6-位脱氢、油脂的不饱和度和碳链延长有明显的影响;Ca2+对脂肪酸△12-位脱氢有促进作用;0.3%NaAC可对△6-和△12-脂肪酸脱氢酶活活性有明显的增强作用;低温培养可明显增强△6-位脂肪酸脱氢和碳链延长的作用。
选取两中培养基A和B(含有0.3%NaAc)和不同培养温度(28℃、25℃、20℃、15℃,最初的4天均为28℃培养),进行摇瓶试验,测定不同培养时间段的参数,来分别分析GLA%(油脂中含量)与生物量、葡萄糖消耗、pH、GLA产量、主要的副产物脂肪酸与脂肪酸分析指标值的时序上变化的规律,进一步探索此两种因素影响GLA合成的机制。结果表明:脂肪酸△6-位的脱氢作用的增强滞后于菌体生长、油脂的合成、脂肪酸碳链延长与脂肪酸△12-位的脱氢程度的增大。在添加有醋酸钠的培养基B中,GLA的合成(△6-位脱氢的作用)较培养基A的时序上有较明显的提前,并且在培养中期(4-5d后)油脂中脂肪酸含量和脂肪酸分析值等就进入基本稳定的状态。这可能是因为pH的控制和醋酸钠可在胞内转化为乙酰CoA。于28℃培养4天后改用低温培养,多不饱和脂肪酸包括GLA的合成的代谢得到增强。并且由于△9-脱氢酶对仅对底物硬脂酰CoA有很强的活性,所以迫使碳链长度(C16→C18)的提高来增加油脂的不饱和度,提高细胞膜的流动性。低温打破了原本培养中后期(4-8d)的脂肪酸含量与分析指标稳定变化趋势,但低温对脂肪酸△12-位的脱氢程度几乎没有影响。