目的：血管性痴呆（vascular dementia, VD）是由一系列脑血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征。在我国VD居老年性痴呆的首位，且随着人口的老龄化，VD的发病呈上升趋势。但目前VD的发病机制尚不清楚，也无特效的防治方法。因此，建立理想的VD动物模型对于探讨其发病机制以及研发防治VD的药物有着重要的意义。近年来的研究表明，颈部血管逐渐狭窄引起的长期慢性脑供血不足是VD形成的重要原因之一。模拟此发病机制的两血管阻断（two-vesselocclusion，2-VO）法，是目前研究VD常用的方法。但由于大脑动脉环的代偿作用和侧枝循环的建立，常难以达到理想的脑缺血效果，且动物的死亡率较高，从而影响模型的稳定性和应用。若能基于2-VO法的原理进行改良，既能提高模型的稳定性，又能降低动物的死亡率，则可能是较为理想的VD动物模型。穿梭箱实验（shuttle box test）用于检测实验动物条件性学习记忆能力，反映动物主动逃避反应，能较客观准确地显示实验动物的痴呆程度。海马与学习记忆密切相关，且对脑缺血敏感。观察海马的形态学改变，可进一步从病理学角度验证模型的稳定性。因此，本实验采用四种不同的改良2-VO法复制VD动物模型，动态观察不同模型小鼠穿梭箱实验的行为学变化以及海马的病理学改变，从而评价出较理想的VD小鼠模型，为VD的防治研究提供新的依据。1动物分组及方法将128只昆明小鼠（28-32g）随机分为：①正常对照组（n=8）小鼠不做任何处理，进行穿梭箱实验。②Sham组（n=24）游离双侧颈总动脉，但不夹闭，不进行尾部放血，于术后15天、30天和45天分别进行穿梭箱实验（每个时间点8只动物）。③模型1组（n=24）夹闭双侧颈总动脉20min，再灌10min，反复3次，同时尾部放血0.3ml。于术后15天、30天和45天分别进行穿梭箱实验（每个时间点8只动物）。④模型2组（n=24）夹闭双侧颈总动脉30min，再灌10min，反复3次，同时尾部放血0.3ml。其余同模型1组。⑤模型3组（n=24）左侧颈总动脉永久性结扎，右侧颈总动脉夹闭30min，再灌10min，反复3次。其余同模型1组。⑥模型4组（n=24）右侧颈总动脉永久性结扎，左侧颈总动脉夹闭30min，再灌10min，反复3次。其余同模型1组。2VD模型的制备将小鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉。在模型1和2中，以动脉夹阻断双侧颈总动脉血流20或30min，再灌10min，反复3次；同时在距鼠尾尖约1cm处断尾，放血约0.3ml。在模型3和4中，用丝线永久性结扎左侧或右侧颈总动脉以阻断血流；同时以动脉夹阻断对侧颈总动脉血流30min，再灌10min，反复3次；不进行尾部放血。假手术组分离双侧颈总动脉，但不阻断血流，不进行尾部放血，其它步骤与模型组相同。3穿梭箱实验测定行为学变化实验装置为一44×28×23cm3的穿梭箱，箱底为可通电的铜栅。第一天将小鼠放入穿梭箱，适应10min。第二天按前一天的顺序将小鼠放入穿梭箱中测定。测定方法为在10s蜂鸣（条件刺激）之后，产生一个1.0mA的交流电刺激，最长持续10s。如果小鼠在蜂鸣刺激过程中，就移动到穿梭箱另一头，则记为一次主动逃避反应。如果小鼠在电击后，移动到穿梭箱另一头，则记为一次被动逃避反应。每只动物连续进行60次循环实验，每次间隔40s，以10次循环为一组，即共有6组循环，统计每10次实验中动物的电击时间和主动逃避的反应率。每组循环间，小鼠休息60s后，进入下组循环。4病理学观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡各组动物均在穿梭箱实验测定后24h断头取材，常规脑组织切片，硫堇染色，在光学显微镜下观察海马CA1区组织形态，确定锥体神经元迟发性死亡（delayed neuronal death，DND）情况。计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片计数3个区段，取平均数为神经元密度（neuronal density，ND）。根据以下标准确定组织学分级（histological grade，HG）：0级，无神经元死亡；Ⅰ级，散在神经元死亡；Ⅱ级，成片神经元死亡；Ⅲ级，几乎全部的神经元死亡。5结果5.1穿梭箱实验行为学结果5.1.1同一VD模型不同时间点小鼠行为学的变化①模型1：与sham组相比，模型组小鼠15天和30天电击时间明显增加（P<0.05），而45天时无统计学差异；模型组15天与30天电击时间无统计学差异，但15天比45天电击时间明显延长（P<0.05），表明该模型小鼠15天时条件性学习记忆能力下降最明显，随后逐渐恢复。②模型2：该模型组小鼠在15天、30天和45天时电击时间均较sham组明显增加（P<0.05），且各组间无差异，表明该模型小鼠条件性学习记忆能力下降较明显且持续时间较长。③模型3：与sham组相比，模型组小鼠15天、30天和45天电击时间均明显增加（P<0.05），且各组间无差异，表明该模型小鼠条件性学习记忆能力下降较明显且持续时间较长。④模型4：该模型组小鼠在15天和30天时电击时间较sham组明显增加（P<0.05），但45天时无统计学差异；模型组15天与30天时电击时间无显著性差异，而15天和30天均比45天电击时间明显延长（P<0.05），表明该模型小鼠条件性学习记忆能力下降以15天和30天较明显，随后逐渐恢复。5.1.2同一时间点不同VD模型小鼠行为学的比较15天和30天时，与sham组相比，各模型组电击时间均明显延长（P<0.05），且各组间无统计学差异；表明各VD模型小鼠均出现了明显的条件性学习记忆能力降低。45天时，模型2和3组电击时间均较sham组增加（P<0.05），但模型2和3组间无统计学差异；表明这2个VD模型小鼠仍有学习记忆能力的下降；而模型1和4组电击时间与sham组相比均无显著性差异，表明这2个VD模型小鼠学习记忆能力的下降逐渐恢复。5.2病理学结果5.2.1同一VD模型不同时间点小鼠海马CA1区病理学结果①模型1：正常和sham组小鼠海马CA1区锥体细胞3~5层，排列整齐致密，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰，无细胞缺失。此模型组海马CA1区DND明显；与sham组相比，15天、30天和45天均有HG明显升高，ND显著降低（P<0.05），并且各时间点组间无统计学差异。表明该模型可导致小鼠海马CA1区锥体细胞数量减少，但损伤没有随时间而加重。②模型2：与sham组相比，此模型组在15天、30天和45天均有HG显著升高，ND显著降低（P<0.05），且模型组的45天较15天ND降低更明显（P<0.05），表明该模型小鼠海马CA1区锥体细胞的损伤随时间进行性加重。③模型3：与sham组相比，此模型组在15天、30天和45天均有HG明显升高，ND显著降低（P<0.05），同时各时间点组间无统计学差异。表明该模型可导致小鼠海马CA1区锥体细胞数量减少，但损伤没有随时间而加重。④模型4：该模型小鼠海马CA1区变化与模型3相似。5.2.2同一时间点不同VD模型小鼠海马CA1区病理学结果与sham组相比，各模型组小鼠海马CA1区均有HG明显升高，ND显著降低（P<0.05）。在15天和30天各模型组间无显著性差异。但在45天时，模型2和4组均较模型1组ND显著降低（P<0.05），说明双侧颈总动脉夹闭30min组及右侧结扎组均较双侧颈总动脉夹闭20min组锥体细胞损伤严重。而模型2组较模型3组，ND显著降低（P<0.05），说明双侧颈总动脉夹闭30min组较左侧结扎组锥体细胞损伤严重。6结论⑴四种不同的改良2-VO法复制的VD模型均可使小鼠的条件性学习记忆能力下降，海马CA1区锥体神经元出现DND。⑵模型1（双侧颈总动脉夹闭20min+尾部放血）和模型4（右侧颈总动脉结扎+左侧颈总动脉夹闭）可能较适合于主动逃避反应的短期观察；而模型2（双侧颈总动脉夹闭30min+尾部放血）和模型3（左侧颈总动脉结扎+右侧颈总动脉夹闭）可能较适合于主动逃避反应的长期观察。