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玉米是世界上种植最为广泛的农作物之一,需求量在不断增长。因此提高玉米产量十分重要。而玉米产量受诸多生物及非生物胁迫影响,其中低温胁迫是东北地区比较普遍的农业气象灾害,在玉米生长季节,遇低温冷害,会导致叶片失水萎蔫,光合作用降低,花粉活力减弱,影响玉米的产量。因此,创制抗冷玉米新种质和培育玉米新品种就显得尤为重要。本研究利用RACE技术,以W9816为实验材料克隆抗冷基因Zm RLK,构建表达载体并转化拟南芥进行功能验证。同时以玉米骨干自交系Y423为实验材料,对农杆菌介导的玉米遗传转化体系进行优化,并采用农杆菌介导法及花粉管通道法将抗冷基因Zm RLK转入玉米基因组,获得抗冷玉米新种质。具体研究内容及结果如下:1.通过RACE(Rapid Amplification of c DNA Ends)技术克隆到完整的玉米抗冷基因Zm RLK的全长。测序结果表明:该基因的核苷酸序列为2028 bp,编码675个氨基酸,分子量为166.4471 k Da,等电点为4.91。对Zm RLK的氨基酸序列进行生物信息学分析表明,其与高粱,谷子等的相似性达到80%以上。由此可见Zm RLK编码一类进化保守性蛋白。2.以p CAMBIA3301为基础载体,分别以35S和UBI为启动子,成功构建了抗冷基因Zm RLK的植物过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK和干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)。3.将抗冷基因Zm RLK转化拟南芥并进行功能验证,结果表明过表达Zm RLK能提高植株对冷胁迫的耐受能力。4.优化农杆菌介导的玉米遗传转化体系。结果表明:当重悬后菌液浓度为OD600=0.55时,侵染时间为25 min,AS浓度为100μmol/L时,转化效率最高。分化培养基中当NAA的浓度为0.5 mg/L、6-BA的浓度为0.5 mg/L时,转化再生率最高。5.农杆菌介导的玉米遗传转化(1)以玉米骨干自交系Y423幼胚为受体,利用农杆菌介导法侵染12000个幼胚。其中过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK共侵染了6000个幼胚,经3 mg/L双丙氨膦筛选愈伤后,分化成苗2207株,分子检测获得89株阳性植株,转化率为4.0%;干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了4000个,筛选后分化成苗1845株,获得121株阳性植株,转化率为6.6%;空载体侵染2000个,筛选后分化成苗693株,获得31株阳性植株,转化率为4.5%。(2)以玉米骨干自交系Y423体细胞胚胎[1]为受体,利用农杆菌介导法侵染了12000块愈伤组织。其中过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK侵染了7200块,经双丙氨膦筛选愈伤,分化成苗946株,分子检测获得63株阳性植株,转化率为6.7%;干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了3800块,分化成苗343株,获得20株阳性植株,转化率为5.8%;空载体侵染了1000块,分化成苗103株,获得8株阳性植株,转化率为7.8%。6.通过花粉管通道法将含有抗冷基因Zm RLK的表达载体转入玉米骨干自交系郑58、昌7-2。收获T0代植株共75穗,得到12530粒种子。其中过表达载体30穗,共5221粒;干扰载体27穗,共4706粒;空载体18穗,共2603粒。经过田间2‰浓度的Basta筛选及分子检测,获得68株阳性植株,其中过表达载体27株,干扰载体21株,空载体20株,转化率分别为0.52%,0.45%,0.77%。将T0代种子自交,获得T1代种子。按照同样方法进行加代并检测,目前已获得T2代种子共2638粒。