论文部分内容阅读
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种人兽共患传染病,在全球范围内流行,是目前病死率最高的传染病之一,一旦感染出现临床症状,几乎100%的死亡。犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper vrus,CDV)引起的高度接触性传染病,它在全球范围内流行,死亡率高达80%,给养犬业和毛皮动物养殖业造成严重的危害。预防接种是控制狂犬病和犬瘟热的主要途径。目前,传统的狂犬病弱毒疫苗成本低廉,但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患;进口疫苗安全性高,免疫效果好,但价格昂贵,难以广泛推广使用。研制安全、高效、成本低廉的动物狂犬病疫苗,仍具现实意义。市场上应用广泛的犬瘟热疫苗存在热稳定性差、免疫效果易受母源抗体干扰等多重问题。因此,研制安全、高效的新型CD疫苗具有重要意义。本研究利用已建立的狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)反向遗传操作技术平台,在通过反向遗传拯救的狂犬病病毒弱毒株HEP-d G的基础上,运用分子生物学技术在狂犬病病毒(HEP-d G株)基因组G与L之间再插入犬瘟热病毒H基因,构建了重组全长c DNA质粒p HEP-d G(H),成功拯救出同时表达狂犬病病毒双G蛋白和犬瘟热病毒H蛋白的重组狂犬病病毒HEP-d G(H)。通过对重组病毒的生物学特性研究,该重组狂犬病毒HEP-d G(H)可以在BHK细胞上稳定的增殖,达到较高的病毒滴度。抽取该重组病毒第2、5、10代的RNA,进行RT-PCR扩增H、d G基因并测序,基因未发生突变。荧光定量PCR和Western blot验证表明外源基因H和d G能够表达。病毒的生长曲线表明HEP-d G(H)保持着与HEP-d G毒株相似的生长特性,在96h达到高峰,但重组病毒HEP-d G(H)的滴度在每个时间点略低于HEP-d G毒株。病毒的扩散感染实验显示在低MOI的情况下,重组病毒HEP-d G(H)的扩散能力不及HEP-d G毒株,这与生长曲线相吻合。致病性实验显示,重组病毒HEP-d G(H)与HEP-d G对6-7周龄成鼠没有致死性,且重组病毒HEP-d G(H)对成鼠体重的影响弱于HEP-d G;而对3日龄内的乳鼠,结果显示HEP-d G(H)的致命性高于HEP-d G。免疫原性实验显示,重组病毒HEP-d G(H)与HEP-d G均能诱导小鼠产生抗狂犬病的抗体,在7 d时抗体已达到保护水平(0.5 EU),且HEP-d G(H)可诱导产生CDV中和抗体。攻毒试验显示HEP-d G(H)与HEP-d G免疫3周后,诱导的RABV抗体水平能够抵御CVS-24的攻击,这些结果表明,重组的狂犬病病毒可以作为有潜力的疫苗候选株。综上所述,重组狂犬病病毒HEP-d G(H)具有良好的免疫原性,具有作为新型基因工程疫苗的潜质,本研究为犬的新型多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。