目的：　　miR-320a是多种常见恶性肿瘤的抑瘤 miRNA，其表达异常减少与这些肿瘤的发生、发展密切相关，但该 miRNA在胶质瘤中的表达情况如何，其与胶质瘤的良恶性级别及患者预后有何关系尚不清楚。生物信息学预测显示葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1基因SND1及β-连环蛋白基因CTNNB1均是miR-320a的潜在靶基因，且其编码蛋白的表达水平均随胶质瘤良恶性级别的升高而升高，但在胶质瘤细胞中两种基因是否是 miR-320a的天然靶基因，两种蛋白的表达水平与miR-320a的关系如何，尚需观察与证实。此外，miR-320a对胶质瘤的增殖和迁移侵袭有何影响，SND1和β-catenin在其中发挥了何种作用，其下游相关效应通路如何亦需进一步探讨。本研究以不同级别人胶质瘤标本和人胶质母细胞瘤细胞系为研究对象，对上述问题进行深入系统的研究。　　方法：　　1.采用组织微阵列和锁定寡核苷酸探针原位杂交技术，在120例不同级别胶质瘤组织标本及20例对照脑组织中检测miR-320a的阳性标记指数（LI％），分析不同级别胶质瘤 miR-320a的表达变化，结合临床随访资料，通过 Kaplan-Meiers生存分析探讨其表达水平与患者生存期之间的关系。采用茎环 qRT-PCR检测、比较永生化胶质细胞系和7种胶质母细胞瘤（GBM）细胞系miR-320a的表达水平。　　2.利用miR-320a mimics转染人GBM细胞系U87MG及U251，利用茎环qRT-PCR验证瞬时转染效率，采用CCK8、体外克隆形成实验、transwell体外迁移侵袭实验以及细胞划痕实验观察外源性补充miR-320a对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。　　3.采用生物信息学分析预测 miR-320a的潜在靶点，通过荧光素酶实验在U87MG及U251中验证SND1和β-catenin的mRNA是否为miR-320a的靶mRNA。采用qRT-PCR及Western blot技术检测转染miR-320a后上述GBM细胞系SND1和β-catenin mRNA及蛋白表达水平的变化，探索miR-320a敲低SND1和β-catenin表达的分子机制。　　4.采用组织微阵列和免疫组织化学方法，检测同批次胶质瘤及对照脑组织标本中Ki-67以及SND1和β-catenin的蛋白表达水平，分析各检测指标与胶质瘤良恶性级别之间的关系以及其与miR-320a含量之间的相关性，寻找miR-320a调节 SND1和β-catenin表达的组织学证据。结合临床随访资料，通过Kaplan-Meiers生存分析探讨SND1和β-catenin表达水平与患者生存期之间的关系，并用单因素及多因素COX比例风险回归模型筛选胶质瘤患者预后的独立预测因子。　　5．利用CCK8实验、EDU细胞增殖实验和流式细胞术（FCM）检测miR-320a转染对 U87MG及 U251细胞系细胞增殖和细胞周期分布的影响；在此基础上，通过转染SND1或β-catenin真核表达质粒提高miR-320a转染细胞中相应蛋白的表达水平，观察其是否可逆转miR-320a对细胞增殖和细胞周期分布的影响。利用 Western blot检测上述各组细胞 p21WAF1和 cyclin D1的表达水平，以明确miR-320a抑制GBM细胞增殖的效应通路和分子机制。　　6.利用transwell体外迁移侵袭实验观察miR-320a转染对GBM细胞系迁移和侵袭的影响以及补充外源性SND1或β-catenin是否能逆转miR-320a对迁移侵袭的抑制作用。通过明胶酶谱分析和酪蛋白酶谱分析检测miR-320a转染后细胞培养基中MMP2和MMP7基质金属蛋白酶活性的变化，通过qRT-PCR检测转染miR-320a对细胞内MMP2和MMP7 mRNA含量的影响。通过Western blot检测转染miR-320a对GBM细胞系MMP2和MMP7蛋白表达的影响以及补充外源性SND1或β-catenin能否逆转该影响，以明确miR-320a抑制GBM细胞迁移侵袭的效应通路和分子机制。　　7.利用重组慢病毒感染建立稳定敲低SND1的U87MG及U251亚细胞系及对照亚细胞系，通过transwell体外迁移侵袭实验进一步验证SND1对GBM细胞迁移侵袭的影响。采用qRT-PCR检测各亚细胞系总Smad2（T-Smad2）、Smad4以及MMP2 mRNA含量。利用Western blot检测U87MG各亚细胞系总T-Smad2、P-Smad2、Smad4以及MMP2的蛋白水平以及外源性TGFβ1处理对其表达的影响，以探讨SND1调节MMP2表达的分子机制。　　结果：　　1.原位杂交结果显示，各胶质瘤组miR-320a表达含量均明显低于非肿瘤对照脑组织，并随肿瘤良恶性级别的升高而相应降低，各胶质组与对照组之间以及各级别胶质瘤组间的差异均有统计学意义（P<0.001）。Kaplan-Meier生存分析显示，在各级别组及所有120例胶质瘤患者中高表达miR-320a患者的无进展生存时间（DFS）和总生存时间（OS）均明显高于低表达miR-320a患者，差异有统计学意义（P<0.0001）。茎环 qRT-PCR检测结果显示，永生化胶质细胞 UC2中 miR-320a水平明显高于其它各胶质瘤细胞系，差异有统计学意义（P<0.01~0.001）。　　2. CCK8实验和体外克隆形成实验结果显示，miR-320a转染可明显降低U87MG及U251细胞的增殖活性和U251细胞的克隆形成效率；Transwell体外迁移侵袭实验结果显示，miR-320a转染可明显降低两种 GBM细胞的迁移和侵袭能力。　　3.生物信息学分析显示，SND1和CTNNB1基因均为miR-320a的潜在靶基因。荧光素酶实验结果显示，含 miR-320a靶序列的野生型 SND1或β-catenin mRNA的3’UTR均可介导 miR-320a对荧光素酶报告基因的沉默作用，而删除miR-320a靶序列的突变型3’UTR不能介导上述沉默作用。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，miR-320a转染组SND1和β-catenin的mRNA及蛋白水平均明显低于无义对照序列转染组，差异有显著性（P<0.05~0.001）。以上结果证实在胶质瘤细胞中SND1和CTNNB1基因均为miR-320a的靶基因，miR-320a通过与SND1和β-catenin mRNA3’UTR上的靶序列结合诱导mRNA的降解并抑制其编码蛋白的表达。　　4.免疫组织化学检测结果显示，各胶质瘤组SND1、β-catenin及Ki-67 LI%均明显高于非肿瘤对照脑组织，并均随肿瘤的良恶性级别的升高而升高，各胶质瘤组与对照组间以及各级别胶质瘤组间差异均有统计学意义（ P<0.001）。Pearson相关分析显示，miR-320a LI%分别与Ki-67、SND1及β-catenin LI%呈显著负相关性(Ki-67, r=-0.976;SND1, r=-0.981;β-catenin, r=-0.975)，而Ki-67 LI%分别与SND1和β-catenin LI%呈显著正相关性(SND1, r=0.984;β-catenin, r=0.975)。生存分析证实，在各级别组和所有120例胶质瘤患者中，SND1及β-catenin高表达组的DFS和OS均明显低于SND1及β-catenin低表达组，差异有统计学意义（P<0.0001）。Cox回归分析显示，miR-320a LI%为胶质瘤患者DFS和OS的保护性因素，而SND1和β-catenin LI%为其风险因素，其中miR-320a与SND1 LI%可作为胶质瘤患者预后的独立预测因子。　　5. CCK8、EdU检测结果显示，miR-320a转染可明显降低U87MG及U251细胞的增殖活性，而通过真核表达质粒转染提高细胞内SND1和β-catenin表达水平可有效逆转miR-320a的增殖抑制作用。FCM检测结果显示，miR-320a转染使 G0/G1期的细胞比例明显高于无义对照序列转染组；而提高 SND1和β-catenin表达水平则可逆转miR-320a对细胞周期分布的影响。Western blot检测结果显示，miR-320a可提高GBM细胞内p21WAF1的表达水平并降低cyclin D1的表达水平，且上述调控作用可分别被SND1和β-catenin真核表达质粒转染所逆转。以上结果证实miR-320a可分别通过敲低SND1和β-catenin上调p21WAF1和下调cyclin D1的表达，从而诱导GBM细胞的G1期阻滞。　　6.体外迁移侵袭实验结果显示，miR-320a转染组细胞的迁移侵袭能力明显低于无义对照序列转染组，而提高细胞内SND1或β-catenin的表达水平可有效逆转 miR-320a对迁移侵袭的抑制作用。明胶和酪蛋白酶谱分析结果显示， miR-320a转染可降低U87MG与U251细胞培养基中MMP2和MMP7的活性。qRT-PCR检测结果显示，miR-320a转染组细胞内MMP2和MMP7 mRNA含量显著低于对照转染组。Western blot检测结果显示，miR-320a转染可下调GBM细胞MMP2和MMP7的表达，而上述调节作用可分别被SND1和β-catenin真核表达质粒转染所逆转。以上结果证实， miR-320a可分别通过敲低 SND1和β-catenin抑制MMP2和MMP7的表达，降低细胞的迁移侵袭能力。　　7. Transwell体外迁移侵袭实验结果证实敲低SND1可有效抑制GBM细胞系的迁移侵袭能力。qRT-PCR与Western blot检测结果显示，在稳定敲低SND1的GBM亚细胞系，其Smad2、Smad4和MMP2 mRNA表达水平以及T-Smad2、P-Smad2、Smad4和 MMP2蛋白水平均明显低于对照亚细胞系，证实在人胶质瘤细胞中敲低 SND1可抑制 TGFβ通路关键因子和 MMP2的表达。经外源性TGFβ1刺激后，对照亚细胞系T-Smad2、P-Smad2、Smad4和MMP2蛋白水平均有明显提高，而稳定敲低SND1的GBM亚细胞系除P-Smad2及MMP2的含量略有上升外，其余蛋白含量无明显改变，证实敲低 SND1可降低 GBM细胞TGFβ通路的活性及其对外源性TGFβ的反应性，消弱其诱导MMP2表达的能力。　　结论：　　1.人胶质瘤组织和胶质母细胞瘤细胞系中普遍存在miR-320a表达异常降低， miR-320a表达水平随胶质瘤良恶性级别升高而相应降低，可作为辅助胶质瘤良恶性分级的参考指标。　　2. miR-320a可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，其表达异常降低是GBM细胞快速增殖和活跃迁移侵袭的重要机制，在胶质瘤发生发展中起重要作用。　　3.在胶质瘤细胞中SND1和β-catenin mRNA均是miR-320a的靶mRNA， miR-320a可以其种子序列与SND1和β-catenin mRNA3’UTR上的靶序列结合，诱导二者降解，并在转录后水平抑制SND1和β-catenin蛋白的表达。　　4.在人胶质瘤组织中，SND1和β-catenin表达水平亦随胶质瘤良恶性程度的升高而增加，其表达水平与miR-320a呈显著负相关，说明胶质瘤细胞中miR-320a表达减少是SND1和β-catenin过表达的重要原因。三者的表达水平均与患者的DFS和OS相关，其中miR-320a和SND1 LI%是胶质瘤患者预后的独立预测因子。　　5. miR-320a通过敲低SND1上调p21WAF1的表达水平，通过敲低β-catenin下调cyclin D1的表达水平，从而阻遏GBM细胞G1/S期过渡、诱导细胞的G1期阻滞、抑制细胞的增殖。　　6. miR-320a分别通过敲低SND1和β-catenin抑制MMP2和MMP7的表达，从而起到抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。　　7.敲低SND1可抑制TGFβ通路关键因子的表达，降低GBM细胞TGFβ通路的活性及其对外源性TGFβ刺激的反应性，消弱其上调MMP2表达的能力，这可能是miR-320a通过敲低SND1抑制MMP2表达的重要机制。　　8. miR-320a是胶质瘤的多功能抑瘤因子，其可通过多靶点多通路抑制胶质瘤的增殖和迁移侵袭。上述研究成果为探索胶质瘤发生发展的分子机制提供了重要线索，为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略的制定奠定了理论基础并提供了丰富、可靠的实验数据。