前言　　 器官的发生无一例外具有细胞增殖和细胞凋亡两种行为,并发生在胚胎发育过程中的特定部位和时间,有着严格的时空顺序。细胞增殖是组织和器官发育的基础,而细胞凋亡则赋予了组织结构发育的可塑性[1-4]。近几年的研究表明,细胞凋亡既是胚胎正常发育中的重要事件,又是致畸因素导致胚胎异常发育的重要形式[5-6]。　　 哺乳动物肾脏的发生和发育是一个复杂而又连续的过程,经历了前肾、中肾和后肾三个阶段,最后由后肾发育为成熟肾脏。后肾由输尿管芽和生后肾组织相互诱导形成。前者分化、发育为各级集合管,后者经过细胞凝聚,管状细胞集合以及间质-上皮的转分化发育为肾单位,两者构成肾实质[7-8]。　　 肾脏发育中一个引人注目的事件就是必须经历生长与退化同在、增殖与凋亡并存的矛盾统一过程。其不同发育阶段的差异与增殖和凋亡之间的动态变化直接相关。在前肾、中肾和后肾的发育过程中,都有细胞凋亡的参与[9-10]。例如后肾的发生是建立在输尿管芽与生后肾原基相互诱导的基础上,其中被输尿管芽诱导的间质细胞分化生成肾实质,而未能被输尿管芽诱导的间质细胞则发生凋亡。此外,肾小管由最初的“S”形小管演变成各个节段肾小管的过程中都有凋亡的参与。同样,在肾脏疾病的转归过程中也有细胞凋亡的参与[11-13],通过细胞凋亡有效的清除了过多的,受损的肾细胞或浸润的炎细胞[14-15],但毫无控制的细胞凋亡造成的肾组织细胞的丢失或凋亡不足则引起肾脏的病理改变,前者可以引起慢性肾衰竭后期肾纤维化、肾萎缩等现象,后者将导致某些情况下多细胞状态的持续存在及一系列后续结果[16-18]。　　 凋亡相关蛋白BCL-2家族是细胞凋亡通路的关键调节器,由抗凋亡蛋白(如:BCL-2)和促凋亡蛋白(如:BAX)组成[19-21]。BCL-2蛋白主要分布在线粒体外膜的胞浆面,具有稳定线粒体膜的功能,通过抑制线粒体膜电位的降低、抑制细胞色素C(Cytc)和凋亡诱导因子(AIF)的释放及抑制半胱天冬酶(caspase)的激活而抑制凋亡[22-25]。凋亡相关蛋白BAX正好相反,BAX主要分布在细胞质中,凋亡诱导信号可以使BAX的构象改变,并整合于线粒体的外膜,最终导致线粒体通透转换孔打开,Cytc和AIF释放,引起细胞凋亡[21,26-29]。因此,BCL-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率直接决定了线粒体外膜各种通道的开放程度,形成了细胞凋亡调控的枢纽。　　 肾脏的细胞凋亡受到外因和内因的调控,生长因子是重要的外源性调节因素,而BCL-2家族蛋白则是关键的内源性调节因素[22]。在胚胎肾的发育中,一旦生后肾原基被输尿管芽诱导,其BCL-2水平即明显上调,使间充质细胞成功向上皮细胞转化[30-31],而BCL-2的丢失或许影响着肾脏分化/成熟的能力[32]。BCL-2敲除的动物模型其生后肾原基的间充质细胞将发生恶性凋亡,出生时即表现为肾发育不全,之后则发育为多囊肾[30-31,33]。　　 肾脏在实现其生理功能从低级到高级的长期进化中形成了空间排列精致的微细结构,其与功能相辅相成是实现肾重要生理功能的保证。在皮髓质中两种。肾小管存在着种属差异,这种结构的差异,决定了对肾小球滤过液的重吸收,以及尿液浓缩与稀释等重要肾生理功能的种属差异[34-37]。因此,在探索肾生理及病理现象时,即需要平面结构和立体结构相结合的分析,又需要结构和功能相关联的思维。　　 上世纪80年代之前,组织微细结构的三维研究主要采用对连续二维显微图像的描述。这种传统的组织形态学研究方法工作量繁重又耗时,常常限制了连续切片的数量,微细结构包含的三维形态信息也必然有限。在大存储量,高运算速度的计算机,先进显微镜配上高分辨率的CCD数码相机的配合下,对组织微细结构的三维研究已经发展到数字手段。　　 本研究采用数字手段三维重建肾微细结构,使小鼠肾发育中小管精确走行的描述得以实现,并在此基础上对特定时间的肾组织切片采用免疫组化与计算机三维重建相结合的技术,精确的显示凋亡相关蛋白BCL-2和BAX的表达部位,以及凋亡细胞的分布,并探讨其对肾脏发育的影响。　　 实验方法　　 采用适当浓度的强碱溶液蚀刻环氧树脂以提高免疫反应,并应用高温高压以提高其抗原性,随后检测小鼠肾脏发育过程中增殖与凋亡相关蛋白在树脂切片上的表达。经心脏灌流固定后取E17d和P7d小鼠肾组织块,并树脂812包埋,垂直肾长轴从肾被膜到肾外髓外带2.5μm连续半薄切片,显微镜下获取数字图像,计算机配准,C语言编程,选取连续切片,树脂切片倒扣再包埋,1μm连续切片,对组织进行BCL-2及BAX免疫组化染色,追踪阳性反应肾小管并三维重建目的小管的走行。最后应用免疫组化、原位末端标记技术并结合体视学分析方法观察E16d、E18d和P1d、P3d、P5d、P7d、P14d、P21d小鼠肾脏不同发育时期BCL-2、BAX及细胞凋亡的演变规律。　　 实验结果　　 1、树脂与石蜡切片上增殖与凋亡相关蛋白的表达及原位末端标记法对凋亡细胞的检测　　 凋亡相关蛋白BCL-2和BAX在树脂切片与石蜡切片的表达一致,但树脂切片的组织结构比石蜡切片更完整。增殖相关蛋白K167的阳性表达只出现在石蜡切片上,在树脂切片上则没有表达。　　 TUNEL阳性细胞在树脂切片与石蜡切片的表达一致,而且,树脂切片比石蜡切片展示了更为良好的组织结构。　　 2、树脂切片上BCL-2和BAX的免疫荧光双标　　 在树脂切片上也可以显示凋亡相关蛋白BCL-2和BAX的免疫荧光双标染色。通过免疫荧光双标染色可见,P14d时,BCL-2和BAX的表达位于皮质全层的小管内,部分小管细胞BCL-2(绿色荧光)和BAX(红色荧光)表达重叠呈黄色,部分小管细胞只有BCL-2表达。　　 3、倒扣再包埋切片上BCL-2和BAX阳性表达小管的三维追踪　　 通过追踪显示,E17d和P7dBCL-2和BAX的阳性表达主要位于深层肾皮质区的近端小管。阳性反应强的肾小管均为成熟的近端小管,发育中近端小管的表达为弱阳性。远端小管几乎不表达,如有也呈弱阳性。生肾区各结构及肾小体无表达,髓质到乳头区小管横断面上也有微弱表达。阳性强度为+++的肾小管均为长髓袢肾单位的肾小管,阳性强度为++的肾小管均为短髓袢肾单位的肾小管。　　 4、小鼠肾脏不同发育阶段BCL-2及BAX的表达　　 在肾脏的发育过程中,BCL-2及BAX主要表达于成熟近端小管上皮细胞,发育中的近端小管和远端小管表达较弱,生肾区各结构及肾小体无BCL-2及BAX的表达。从P1d～P21d,BCL-2和BAX的表达由皮质的近髓质区逐渐发展到中层皮质区最后扩展到整个肾皮质区。其中,皮质迷路中的近端小管(近曲小管)表达较强,髓放线和外髓外带中的近端小管(近直小管)表达微弱,远端小管表达较弱,髓质的其他部分未见表达。　　 免疫荧光显示,部分小管细胞BCL-2和BAX的表达重叠,部分小管细胞只有BCL-2的表达。根据细胞形态特征,共表达的部位均为成熟的近端小管曲部细胞,而只有BCL-2表达的细胞的形态特征与未成熟近端小管或远端小管细胞形态相似。　　 5、小鼠肾脏不同发育阶段BCL-2/BAX数量的变化　　 BCL-2阳性表达肾小管的面数密度(NA)从E18d到P1d增长速度最快,P7d之后变化不大;BAX阳性表达肾小管的NA从E16d到P3d逐渐升高,随后短暂下降,在P7d又开始逐渐升高;BCL-2/BAX比值从P3d开始升高,在P7d时达到顶峰,随后降低。　　 6、小鼠肾脏不同发育阶段TUNEL阳性细胞的表达　　 在肾脏的发育过程中,生肾区的各个结构均有少量TUNEL阳性细胞,皮质区肾小体、肾小管和间充质细胞以及肾髓质乳头区小管的凋亡细胞多见。随着发育的不断进行,生肾区的凋亡细胞以基质细胞为主,皮质区的凋亡细胞则以肾小管细胞为主,间充质细胞阳性表达较普遍,肾乳头区的大量凋亡细胞在发育的后期减少。　　 7、小鼠肾脏不同发育阶段凋亡指数的变化　　 肾小体的凋亡指数(AI)在P14d达到高峰,随后显著下降,而肾小管的AI在P7d之后变化不大。肾乳头区的AI明显大于肾小管和肾小体的AI,但从P14d～P21d则大幅降低。　　 结论　　 1、树脂切片上的免疫组化既可以特异性的显示蛋白的定位表达也展示了保存良好的组织结构,为结构的三维重建和追踪打下基础。计算机辅助的肾微细结构三维重建,为小鼠肾发育过程中肾小管空间走行的研究提供了一个更为有效的平台。　　 2、在肾脏的发育过程中,BCL-2和BAX的表达与近端小管的发育密切相关。与凋亡的发生并不存在直接关系。BCL-2和BAX的表达是肾发育过程中近端小管上皮细胞生长或上皮损伤后修复能力的体现,与线粒体的融合或分裂,与细胞粘附或迁移有关。是肾近端小管成熟的标志。