一、研究背景人口老龄化是目前困扰全球的问题,特别在我国,随着人口基数的增加和老龄化速度的加快,骨质疏松患者已达到9000余万,临床医生将面对大量骨质疏松伴骨缺损的病例。在骨质疏松环境下,破骨细胞活性增强,骨吸收大于骨形成,新骨生成能力下降,骨缺损愈合明显延迟,故治疗较单纯骨缺损更为棘手。传统的自体及异体骨移植仍是首选,但各自均存在难以克服的缺点,载体+因子的生物治疗模式取得了较好疗效,但载体材料有待进一步改进。虽然CPC携载骨生长因子治疗单纯骨缺损成果显著,但由于CPC的因子释放能力有限,而且骨质疏松骨缺损的愈合需要较高浓度的因子水平,故其在骨质疏松环璄下的应用受限。可降解微球携载因子后复合CPC,不仅使因子释放量大大增加,而且微球可降解成孔,明显加速材料的降解(解决CPC降解缓慢的临床应用障碍)。目前,主要以PLGA为材料制备微球,PLGA作为无机高分子物质,存在以下缺点:1、缓慢的降解速率阻碍新生骨组织的长入;2、降解产物呈酸性,累积后可损伤周围组织及细胞。明胶微球生物相容性好,常用作药物载体,微球经交联后降解可调,但常用的交联剂如GA细胞毒性较强,限制了明胶微球的应用,新型生物交联剂GP的出现有望解决这一问题,使明胶微球代替PLGA作为CPC的良好改性材料。二、研究目的1.以GP作为交联剂制备明胶微球,与GA交联的微球进行比较,探讨GP交联微球的性能优缺点,为多孔CPC的制备提供致孔材料。2.通过对孔径率、生物力学强度及X线衍射等指标进行分析,确定复合型多孔CPC中明胶与骨水泥的最佳配比;并进行体外细胞实验及体内动物实验,综合评估多孔CPC的生物相容性。3.明胶微球携载rhBMP-2后复合CPC制备新型多孔人工骨,测定其体外因子缓释曲线,通过细胞实验及体内异位成骨实验评估其成骨能力。4.在绝经后骨质疏松模型体内,采用“二维组织形态-三维CT成像-生物力学特性”的综合手段,评估新型人工骨对促进骨质疏松骨缺损愈合、改善骨小梁微观结构及提高椎体生物力学强度的作用。三、研究内容和方法1.以改进的双相乳化冷凝聚合法制备明胶微球,分别以GP及GA进行交联。取60%交联度的GP及GA明胶微球,分散于PBS中,比较其粒径外观、溶胀及降解性能;两种微球分别携载rhBMP-2,测定载药量及包封率,观察10天内的药物缓释性能;收集GP及GA明胶微球浸提液,倍比稀释成100%、50%及25%的浓度,分别与小鼠成骨细胞共培养2天,以DMEM组为空白对照,MTT法检测细胞增殖,确定GP及GA微球的细胞毒级。2.GP交联明胶微球以不同比例与CPC复合(0 wt%,2.5 wt%,5 wt%),制备多孔CPC,浸泡于PBS中1、3及5周后,测定材料孔径率、抗压强度及XRD情况,筛选出最佳比例。消化法培养成骨细胞接种于常规及多孔CPC支架上,SEM观察细胞形态;不同材料浸提液(0 wt %,2.5 wt% GM/CPC及聚苯乙烯)分别与成骨细胞共培养,钙黄绿素-AM及碘化苯啶标记后观察细胞生长状况,MTT法测定细胞增殖率,试剂盒测定ALP水平。CPC及GM/CPC分别植入山羊椎体骨缺损处,术后6周处死山羊,收集椎体标本,部分椎体制作不脱钙切片,丽春红三色染色后观察骨组织生长及材料降解情况,其余标体脱钙后制作石蜡切片,HE染色后观察组织炎症反应、骨组织生长及材料降解情况。3.载rhBMP-2的明胶微球与CPC混合制备载因子多孔人工骨作为实验组(A),rhBMP-2/CPC作为对照组(B)。两者分别浸泡于5ml生理盐水,在1、4、7、14、21、28天时收集全部浸提液,ELISA法测定rhBMP-2的浓度,计算出各个时间点的累积释药量;两种材料浸提液分别与成骨细胞共培养,测定细胞增殖、ALP水平及钙化结节情况;材料植入小鼠大腿肌袋,术后3周处死小鼠,切取材料及周围组织,HE染色后进行组织学观察,同时测定材料周围组织中ALP及钙含量。4.以卵巢切除法对15只成年山羊去势,低钙膳食6个月后建立骨质疏松模型。手术去除每只动物L2、L4椎体部分侧方骨质,造成约5 mm×10 mm×10 mm大小骨缺损,随机选取3只山羊不作任何处理,作为空白对照组观察骨缺损自愈情况。其余动物随机分成两组:实验组(A)植入rhBMP-2/GM/CPC;对照组(B)植入rhBMP-2/CPC。术后1周、7周及25周CT扫描后三维成像观察骨缺损愈合情况;术后7周及25周分两批处死动物,采用双能X线吸收骨密度仪测定手术椎体骨密度,组织病理学观察骨小梁微观结构及材料降解成骨情况,生物力学实验评估椎体骨质的结构力学强度。四、研究结果1. GP交联明胶微球需3天达到稳定的交联度,60%交联度的GP及GA微球在溶液中均呈规则圆形,粒径分别为78±18μm及74±10μm,载药量、包封率未见明显差异,但GP微球分散性更佳,溶胀率(89.0±4.8%)及10天内释药总量(78.8±4.96%)明显低于GA微球(118.0±7.6%、90.5±5.12%),抗降解能力(28天)强于GA微球(21天),100%、50%及25%浓度的GP浸提液细胞毒级均为Ⅰ级,而相应GA微球的细胞毒级分别为Ⅲ、Ⅲ及Ⅱ级。2.GM/CPC的总孔径率、大孔率均随浸泡时间的延长而增加,但抗压强度逐渐下降,其中2.5 wt% GM/CPC最终具有相对较高的孔径率(65.5±1.12%)及较好的生物力学强度(6.3±0.6Mpa)。成骨细胞在多孔CPC支架上生长良好,细胞增殖及ALP水平均明显高于单纯CPC组,与聚苯乙烯组未见明显差异。两组材料植入体内3个月后,均未见不良炎症反应,多孔CPC可见材料边缘明胶微球降解,新生骨组织长入,有多核细胞出现降解材料,而单纯CPC无明显降解,材料内部无骨组织长入。3.两种CPC的因子缓释曲线均由两部分组成:1天内的爆发式突释及随后的缓慢平稳释放;除第1天外,其余时间点多孔CPC的因子累积释放量均高于单纯CPC;28天后多孔CPC的累积释药量约为37.8±2.3%,明显高于单纯CPC的14.7±1.9%。A组成骨细胞增殖及ALP水平明显高于B组,且细胞形成的钙结节数量多形状大。体内实验发现两组均可见软骨形成,但A组软骨量更多,材料周围组织ALP及钙含量测定A组也明显高于B组。4.三维CT成像显示:空白对照组术后25周在椎体上仍可见较大骨缺损存在;A组骨缺损修复显著快于B组,且材料降解较快,剩余材料较B组少。组织病理学结果表明:术后7周A组的平均骨矿化率高于B组,但术后25周未见明显差异;A组的骨小梁三维结构(平均骨小梁厚度及密度、结点末端比)明显优于B组,而平均骨小梁间距低于B组;A组材料降解较快,25周后剩余材料约为50%,且可见大量新生骨长入,B组几乎未见明显降解,无新生骨长入。骨密度检测显示术后6周两组未见明显差异,但25周后A组明显高于B组。生物力学试验结果表明,术后7周及25周A组分别为4.2±1.2 MPa及7.8±1.4MPa,明显高于B组的2.4±0.9 MPa及4.6±0.8MPa。五.结论1.GP交联明胶微球所需时间稍长,60%交联度的明胶微球降解时间约28天左右,适合作为CPC的成孔材料,而且其缓释性能及生物相容性更佳,可广泛应用于骨组织工程领域。2.利用明胶微球可成功制备多孔CPC,微球在2.5%比重时,材料孔径率高,强度较以前同等孔径率的多孔材料有一定改善。复合材料具有极好的生物相容性,微球在体内可缓慢降解成孔,使新生骨组织长入,从而更加速复合材料的降解,是良好的骨组织工程支架材料。3.多孔CPC复合rhBMP-2与单纯rhBMP-2/CPC相比,因子的释放能力及骨诱导性能均有所提高。这种新型人工骨可加速骨质疏松骨缺损的愈合,显著改善局部骨微结构,增强局部骨生物力学性能,适合作为骨质疏松骨缺损生物治疗的理想材料。