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目的:
研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后血脑屏障渗透改变和RhoA、GAP-43及Claudin-5蛋白的表达变化及Rho激酶抑制剂法舒地尔对其的影响,并探讨Rho激酶在脑缺血中的作用及Rho激酶抑制剂法舒地尔调控脑缺血后神经血管单元的机制。
材料和方法:
采用Longa改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2h再灌注脑缺血模型。选用清洁级健康雄性SD大鼠102只,随机分为:假手术组(sham operated group,SG)、缺血再灌注模型组(modelgroup,MG)、缺血再灌注生理盐水治疗组(physiologic saline group,PG)、缺血再灌注法舒地尔治疗组(fasudil group,FG)。根据缺血再灌注时间不同分为缺血再灌注6h、1d、3d、7d4个时间点进行观察。FG在再灌注的同时经腹腔注射Rho激酶抑制剂法舒地尔,剂量为15mg/kg;PG则于再灌注同时经腹腔注射相应剂量的生理盐水;每日一次至实验结束。采用Longa5级4分法评价神经功能缺损;HE染色观察病理学变化;伊文思蓝(Evans blue,EB)法测定脑缺血后血脑屏障fblood-brain barrier,BBB)渗透改变;免疫组织化学染色和WesternBlot检测RhoA、GAP-43和Claudin-5蛋白表达的变化及法舒地尔干预后对其表达的影响。
结果:
1.法舒地尔对大鼠脑缺血后神经功能的影响:假手术组大鼠无神经功能缺损,缺血再灌注模型组、生理盐水及法舒地尔治疗组均有不同程度的神经功能缺损;但是与模型组和生理盐水组相比,法舒地尔治疗组可明显促进神经功能缺损的恢复,神经行为学评分有显著性差异(p<0.01)。
2.法舒地尔对大鼠脑缺血后BBB渗透改变的影响:缺血再灌注24h法舒地尔治疗组EB含量较其余三组明显降低(P<0.01)。
3.法舒地尔对大鼠脑缺血后RhoA表达影响:缺血再灌注6h时各组RhoA蛋白表达无明显差异,再灌注1d时模型组和生理盐水组RhoA蛋白含量开始增高,这种趋势持续至7d。再灌注3d和7d时,法舒地尔组RhoA表达较模型组和生理盐水组显著降低(P<0.01)。
4.法舒地尔对大鼠脑缺血后GAP-43表达影响:缺血再灌注6h和1d时法舒地尔组GAP-43蛋白含量较其他三组均明显增高(P<0.01),再灌注7d时法舒地,尔组、模型组和生理盐水组GAP-43蛋白含量均增高,与假手术组相比有显著性差异(p<0.01),而法舒地尔组GAP-43蛋白含量较模型组和生理盐水组明显增高(P<0.01)。
5.法舒地尔对大鼠脑缺血后Claudin-5表达影响:缺血再灌注6h、1d、3d、7d法舒地尔组、模型组和生理盐水组Claudin-5蛋白的表达较假手术组均显著降低(P<0.01):但再灌注3d时法舒地尔组Claudin-5蛋白表达较模型组和生理盐水组增高(P<0.05),并持续至7d,缺血再灌注7d时虽未达到假手术组表达水平,但已显著高于模型组和生理盐水组(P<0.01)。
结论:
脑缺血后RhoA、GAP-43及Claudin-5蛋白表达随时间发生变化,Rho激酶抑制剂法舒地尔可能通过抑制RhoA的表达,增加GAP-43和Claudin-5的表达,来减轻血脑屏障渗透损害,促进神经功能恢复,提示Rho激酶在脑缺血后神经血管单元损害中发挥一定的作用,针对Rho激酶进行干预可能是脑缺血治疗的一个新靶点。