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本试验从黄芪多糖(APS)调节雏鸡肠道免疫功能入手,研究chTLR4及其信号转导通路在此过程中的作用。首先,用Trizol法提取雏鸡胸腺中总RNA,反转录成cDNA,根据GenBank上已公开发表的chTLR4基因序列,选择含有抗原位点较多的区域设计特异性引物,克隆出chTLR4包括胞内区、胞外区、跨膜区的部分片段,大小为1332bp,并构建重组原核质粒pET30a-chTLR4,经过诱导,表达出约为58.5KD大小的重组蛋白,利用纯化后的重组蛋白成功制备出了兔抗chTLR4多克隆抗体,经过间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法鉴定所制备的兔抗chTLR4多克隆抗体,其具有良好的反应性及特异性。之后,将7日龄雏鸡随机分为4组,即APS高剂量组(A组)、APS中剂量组(B组)、APS低剂量组(C组)和空白对照组(D组)。其中,A、B、C组雏鸡于7日龄以灌服方式分别给予高、中、低剂量APS,1次/d,连续5d,在首次给药后1、3、5、7d,取雏鸡十二指肠肠液以及十二指肠、空肠、回肠、法氏囊,采用实时荧光定量PCR、免疫酶组织化学法及间接ELISA技术对雏鸡肠道chTLR4及其信号转导通路相关信号分子(chMyD88、chTRIF、 NF-κB、chIRF3)活化情况、细胞因子(chIFN-β、TNF-α)及sIgA动态变化进行检测。结果发现,7日龄雏鸡经连续五天灌服APS后,8日龄时APS高剂量组(A组)十二指肠中的chTLR4mRNA的表达量极显著高于对照组(D组)(P<0.01),随后下降,并极显著低于对照组(P<0.01)；APS中剂量组(B组)十二指肠中的chTLR4mRNA表达量在10～14日龄均极显著低于对照组(P<0.01)；APS低剂量组(C组)雏鸡在14日龄时表达量极显著高于对照组(P<0.01)。A组法氏囊中的chTLR4mRNA表达量在12日龄极显著高于D组(P<0.01);B组法氏囊中的chTLR4mRNA表达量持续上升,14日龄时达到峰值极显著高于D组(P<0.01)；10-14日龄,C组法氏囊chTLR4mRNA表达量变化趋势与B组一致,且14日龄极显著高于D组(P<0.01)。雏鸡十二指肠、空肠、回肠中chTLR4蛋白表达的变化趋势与十二指肠chTLR4mRNA的表达变化趋势基本一致。雏鸡十二指肠、法氏囊chTLR4信号转导通路中衔接蛋白分子chTRIF、下游转录因子(NF-κB、chIRF3)及其诱导产物(chIFN-β、 TNF-α)mRNA的表达趋势与chTLR4基本相同；而chTLR4的另一个衔接蛋白分子chMyD88mRNA仅在8日龄(B、C组)、10日龄(A组)明显高于D组(P<0.01或P<0.05),之后降低,14日龄时与D组比较差异不显著。表明APS饲喂雏鸡肠道chTLR4信号转导通路中活化途径主要为chTRIF途径。另外,雏鸡经连续灌服5d APS后,A、B组雏鸡十二指肠sIgA的含量自8日龄至14日龄均呈现先上升后下降的趋势,A组雏鸡sIgA含量在12日龄达到顶峰,B组雏鸡sIgA含量在10日龄时达到顶峰；C组雏鸡肠道sIgA的含量变化趋势为先升高后下降,随后在14日龄再升高至顶峰且sIgA的含量高于A、B、D三组。表明APS能够提高雏鸡十二指肠sIgA含量。本研究从基因和蛋白表达水平证实,chTLR4及其信号转导通路参与了APS调节雏鸡肠道免疫的过程,进一步从雏鸡体内模式识别及信号转导的角度阐明APS调节雏鸡免疫功能的分子机制,为临床更加科学地应用APS及提高雏鸡抗病能力提供科学依据。