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目的:通过比较正常人与神经胶质瘤患者脑脊液中uPAR浓度以及GPI-PLD酶活性,间接反映两者与神经胶质瘤局部侵袭的关系。同时利用GPI-PLD基因转染人神经胶质瘤U251细胞,初步研究GPI-PLD基因过度表达对细胞膜上糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白质uPAR等的影响,以及神经胶质瘤细胞体外侵袭性的改变,探讨GPI-PLD基因在胶质瘤生长、凋亡和侵袭中的作用,为该基因神经胶质瘤靶向治疗提供了初步理论依据。方法:1.分别取30例正常人、15例神经胶质瘤患者脑脊液测定其uPAR浓度与GPI-PLD酶活性;2.用脂质体转染法将本室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入U251细胞,以未转染的U251细胞及转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为对照,以G418筛选出阳性细胞克隆。RT-PCR法鉴定GPI-PLD基因的mRNA表达水平,利用自制具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)做底物,通过曲拉通-114(TX-114)分相,定量检测GPI-PLD活性;基因稳定转染后观察细胞生物学特性的变化包括MTT法检测各组细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡变化。以未转及转染空载体pcDNA3.1(+)细胞为对照组,pcDNA3.1(+)/GPI-PLD细胞为试验组通过Transwell小室检测U251细胞的体外侵袭能力。结果:1.病人组和正常对照组脑脊液GPI-PLD酶活性(%)分别为30.7±4.6和44.1±4.4,两组差异有显著性(P＜0.05);uPAR浓度分别为2.4±0.6和3.6±0.5(ng/ml),差异有显著性意义(P＜0.05)。2.RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定表明,稳定高表达GPI-PLD的U251细胞系已经建立。(1)G418筛选后,GPI-PLD稳定转染U251细胞的GPI-PLDmRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性(P＜0.05)。(2)GPI-PLD稳定转染U251细胞后,GPI-PLD活性较转染空质粒组和未转染组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.01),转染组细胞的GPI-PLD活性(%)达到13.1±5.6,而其它组细胞GPbPLD活性较低,分别为5.7±3.0和5.9±2.6。(3)GPI-PLD稳定转染U251细胞后,细胞释放uPAR明显增加。pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/U251较pcDNA3.1(+)/U251、U251细胞组培养基上清uPAR浓度显著提高,增高水平达4倍,而pcDNA3.1(+)/U251和U251细胞组见无明显差异。3.GPI-PLD转染前后U251细胞生物学特性的改变。(1)MTT法显示pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/U251、pcDNA3.1(+)/U251、U251细胞组吸光度的平均水平分别为0.392±0.104、0.631±0.187和0.621±0.194;其中,pcDNA3.1(+)/GPbPLD/U251组比pcDNA3.1(+)/U251和U251组吸光度值明显下降,差异有显著性(P＜0.01),pcDNA3.1(+)/U251和U251组无明显差异。表明GPI-PLD基因过表达能抑制U251细胞的增殖。(2)细胞流式术显示pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/U251、pcDNA3.1(+)/U251、U251细胞组S期细胞数分别为9.33%、16.46%、17.1%;但细胞凋亡率没有明显差别。(3)体外侵袭实验24h后,每个样本分别计数5个视野。结果显示pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/U251、pcDNA3.1(+)/U251、U251三组细胞侵袭性显著不同(P＜0.01)。pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/U251细胞侵袭性明显低于pcDNA3.1(+)/U251、U251,提示GPI-PLD能分解GPI锚,导致uPAR从细胞表面脱落,抑制其定位与uPA降解基质的功能和uPAR-uPA介导的信号转导,从而降低U251细胞的体外侵袭性。结论:1.神经胶质瘤患者脑脊液中GPbPLD酶活性以及uPAR的浓度均较正常人降低,差异具有显著性。2.成功将GPI-PLD基因转染入神经胶质瘤U251细胞,并在该细胞中稳定表达。3.GPI-PLD基因转染U251细胞后能影响该细胞周期并降低神经胶质瘤细胞的体外侵袭性。