粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)动员的外周血干细胞(Peripheral blood stem cells, PBSCs)移植,可导致血循环中中性粒细胞及血小板迅速增加,已成为造血干细胞移植的重要方法。然而,新近研究发现,PBSCs可向多种组织细胞分化,其在终末期肝病等多种损伤组织的修复过程中发挥了重要作用。动物实验表明,G-CSF可促进骨髓干细胞向损伤肝脏迁移,诱发内源性肝细胞再生。临床研究也证实,G-CSF动员或PBSCs移植均可有效改善终末期肝病患者的肝功能。本实验室前期研究发现,自体PBSCs经肝动脉回输可提高乙肝相关性终末期肝病患者的白蛋白(Albumin, ALB)水平和CTP(Child-Turcotte-Pugh)评分。然而,PBSCs中存在着多个亚群的干细胞,是哪一亚群的细胞在此过程中发挥了作用,尚不清楚。传统观点认为,外周血中的单核细胞是吞噬细胞的前体细胞,可定向分化为巨噬细胞和树突状细胞。近年来研究发现,循环中的单核细胞具有多向分化的潜能,可诱导分化为肝细胞、骨、心肌、神经细胞和内皮细胞等多种组织细胞。本课题组前期研究也证实,PBSCs中的单核细胞具有干细胞的潜能,可诱导分化为肝细胞样的细胞。另外,多项研究显示,循环中的单核细胞可能是肝硬化逆转的重要调节细胞。单核细胞功能敲除的小鼠,可延缓四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化降解的进程。同时,在损伤的肝脏,巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),进而激活活化星形细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)上的死亡受体,诱导其调亡。然而,单核细胞是否为PBSCs移植治疗终末期肝病真正的效应细胞,在终末期肝病的干细胞治疗中发挥了重要的作用,尚不清楚。【实验目的】1.检测PBSCs中CD14+单核细胞亚群的干细胞潜能;2.比较PBSCs中CD14+单核细胞和CD14-细胞移植对CCl4诱导的大鼠肝硬化的治疗作用;3.探讨CD14+单核细胞参与损伤肝脏修复可能的机制。【材料和方法】1.利用G-CSF动员雄性大鼠的外周血干细胞,以Ficoll为介质通过密度梯度离心法分离PBSCs;2.通过免疫磁珠分选PBSCs中CD14+单核细胞亚群;3.利用形态学、流式细胞仪和细胞化学等检测,观察CD14+单核细胞亚群的干细胞潜能;4.将CCl4诱导的雌性肝硬化大鼠随机分为两组,每组30只,分别从门静脉输注CM-DiI染料标记的CD14+单核细胞或CD14-细胞(1x107cells/rat);5.通过生存分析、血清学和门静脉压力等检测,对比CD14+单核细胞和CD14-细胞移植对大鼠肝硬化的治疗效果;6.通过苦味酸天狼星红染色、Masson三色染色、免疫组化和Real-time PCR等方法,检测细胞移植对大鼠肝纤维化程度的影响;7.通过荧光示踪和Y染色体原位末端标记(Primed in situ labeling,PRINS)技术,观察移植的CD14+单核细胞在损伤肝脏的定植情况;8.通过激光共聚焦检测,观察损伤肝脏中定植细胞的性质;9.通过免疫组化和Real-time PCR等方法,观察单核细胞移植对肝细胞再生能力的影响;10.通过原位凝胶酶谱、凝胶酶谱、Western blot、Real-time PCR和激光共聚焦等方法,探讨单核细胞逆转肝纤维化可能的机制。【结果】1.大鼠PBSCs中CD14+单核细胞亚群的分离及干细胞潜能的鉴定流式细胞仪结果显示,我们分离的PBSCs中的单核细胞,单核细胞标志物CD14和CD11b的表达率分别为95.4%±0.3%和93.7%±1.8%。该亚群的部分细胞可表达造血干细胞标志物CD34(1.1%±0.3%)、CD45(42.8%±4.6%),间充质干细胞标志物CD44(50.1%±4.3%)以及多能干细胞的转录因子Oct3/4(4.2%±1.1%)和Sox2(5.7%±1.5%)。然而,内皮细胞标志物CD133的表达则为阴性。另外,在塑料培养板上,该亚群细胞具有与单核细胞相似的良好的贴壁能力;在无外援性生长因子的作用下,RPMI 1640培养3-5天后,其呈现出干细胞特有的集落生长能力。以上结果说明,PBSCs中CD14+单核细胞亚群具有干细胞潜能。2. PBSCs中CD14+单核细胞和CD14-细胞对大鼠肝硬化治疗效果的比较将CCl4诱导的雌性肝硬化大鼠随机分为两组,每组30只,分别从门静脉输注CD14+单核细胞或CD14-细胞。移植后4周,CD14+单核细胞移植组和CD14-细胞移植组大鼠血清中的ALT和AST水平较移植前均明显减低。然而,相比CD14-细胞移植,CD14+单核细胞移植可有效提高大鼠血清中ALB水平和生存率,降低门静脉压力(p < 0.01)。另外,通过天狼星红染色、Masson三色染色和肝纤维化相关分子(FN、α-SMA和TGF-β)的检测,我们发现CD14+单核细胞移植组大鼠的肝纤维化程度(2.1%±0.9%)较CD14-细胞移植组(11.2%±2.3%)明显减低(p < 0.01)。Real-time PCR结果证实,移植后1周,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝纤维化相关分子(FN,α2-(1)-procollagen,α-SMA和TGF-β)的mRNA表达较CD14-细胞移植组也明显降低(p < 0.01)。3.单核细胞促进损伤肝脏肝细胞再生的机制利用荧光示踪技术,我们发现CM-DiI染料标记的单核细胞在损伤肝脏中有定植,其主要分布于肝小叶的汇管区(86.9%±10.1%),少部分细胞位于肝实质区内(8.4%±2.5%)。PRINS结果也证实,移植的带有Y染色体的单核细胞在雌性肝硬化模型鼠中确有定植。激光共聚焦结果显示,这些定植的细胞中,仅有1.8%±0.4%的细胞具有肝细胞标志物ALB和CK18的表达;另外,肝巨噬/Kuffer细胞标志物F4/80的表达率为62.1%±9.8%,但肝干细胞标志物OV6和纤维母细胞标志物α-SMA的表达为阴性。免疫组化结果显示,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝细胞再生指数Ki-67的表达(移植后1周10.79%±2.98%,2周15.31%±3.24%)较CD14-细胞移植组(移植后1周6.16%±1.24%,2周8.45%±0.98%)明显增加(p < 0.01)。Real-time PCR结果证实,移植后1周,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝细胞再生相关因子(HGF, TGF-α, EGF和VEGF)的mRNA表达,较CD14-细胞移植组也明显增高(p < 0.01)。4.单核细胞促进肝硬化逆转的机制通过原位凝胶酶谱和凝胶酶谱检测,我们发现:CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中MMP-2和-9的活性较CD14-细胞移植组明显增强;同时单核细胞移植后2周,肝组织中MMP-2和-9的分泌活性最高。Western blot结果显示,在CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中,不仅有MMP-2和-9蛋白表达的增加,而且MMP-13的表达也是增高的。Real-time PCR结果证实,移植后1周,相比CD14-细胞移植组,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中MMP-2,-9和-13的mRNA表达增高;另外TIMP-1的mRNA表达降低(p < 0.01)。激光共聚焦结果显示,部分定植的细胞可表达MMP-9和-13,但大部分MMP-9和-13的合成来源于内源性肝组织细胞。【结论】本研究证实了PBSCs中CD14+单核细胞具有干细胞潜能,该亚群细胞的移植较CD14-细胞移植,对大鼠肝硬化具有更好的治疗效果。其参与肝损伤修复的机制是促进内援性肝细胞再生、降解细胞外基质。因此,PBSCs中CD14+单核细胞可能是PBSCs移植治疗终末期肝病真正的效益细胞。