论文部分内容阅读
滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae,MS)能引起蛋鸡严重的关节肿胀,导致蛋鸡产蛋量下降。自2011年开始,蛋鸡滑液囊支原体感染开始在中国流行性感染。近年来,随着感染面积逐步扩大,对家禽养殖业造成巨大的经济损失。本研究从关节肿胀的病鸡中分离出滑液囊支原体,使用PCR特异性引物,检测结果为滑液囊支原体阳性。经序列比对后发现该分离株(MS Shaanxi 2017)与2016年印度发现的分离株Mycoplasma Synoviae strain pal12 16S rRNA片段相似性达到100%,故确定该分离菌株属于MS。基于GenBank公布的MS基因编码区序列设计两对LAMP引物。根据LAMP操作指南建立了针对MS的LAMP检测方法,并比较该方法与普通PCR检测方法的敏感性、特异性。试验结果如下:1.采集疑似MS感染鸡的关节渗出液棉拭子,适当处理后接种到改良Frey氏培养基中,24 h以后传到新的改良Frey氏培养基中,经过37℃的厌氧环境48~72 h培养,培养基颜色由橘红色变为黄色,并且将液体培养基中的分离菌接种到普通鲜血琼脂平板上观察,结果显示无细菌生长,说明该分离菌不是细菌。将已经变黄的培养液挑取到载玻片上,经姬姆萨染色,在100倍油镜下观察到分离菌的形态呈不规则的椭圆形,说明该分离株为MS。2.根据所建立的PCR反应体系,将培养液经过特殊处理后直接作为模板DNA,用MS特异性引物检测,扩增得到一条207 bp大小的特异性条带,且阴性对照成立,证明所检测的样品中含有滑液囊支原体。回收阳性PCR产物并将其连接到T载体上,将测序结果与NCBI数据库上所公布的MS 16S rRNA进行比对,分离株(MS Shaanxi 2017)与2016年印度发现的分离株Mycoplasma Synoviae strain pal12 16S rRNA片段相似性达到100%,故确定该分离菌株属于MS。3.本试验根据MS编码区基因设计两对LAMP扩增引物,通过Bst DNA聚合酶的链置换作用使之进行扩增,在反应结束后加入SYBR Green I核酸染料,根据颜色变化判断结果的阴阳性。本试验针对MS所建立的LAMP检测方法的反应体系进行温度及时间的条件优化,结果显示:最佳的反应温度为63℃,最佳的反应时间为70 min。此外,本试验对所建立的LAMP检测方法进行了敏感性、特异性验证。通过试验证实,LAMP检测方法有较好的敏感性与特异性。最后,分别对20份样品进行检测,使用LAMP检测方法检出10份,普通PCR检出7份。