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1研究目的双丹口服液系收载于《中国药典》（2005、2010年版）一部的中药标准制剂，由丹参、牡丹皮组成，功能为活血化瘀、通络止痛，用于瘀血痹阻所致的胸痹，症见胸闷、心痛。双丹口服液是临床常用制剂，治疗胸痹的有效率达到90%以上，并且能显著改善中医症候。但双丹口服液成分复杂，作用机制不明，难以得到国际认同；因此，对双丹口服液进行分子中药二次开发，阐明其治疗胸痹的机制，有着重要的意义。本课题采用其主要有效成分丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）与丹皮酚（Paeonol，Pae），按照双丹口服液中的含量和配比进行配伍组方，组成分子中药，发挥二者协同作用。采用建立体内动物模型，体外冠状动脉组织培养，人脐静脉内皮细胞模型等方法，探讨和揭示分子中药Sal B配伍Pae抗动脉粥样硬化、扩张冠脉血流、保护内皮细胞的作用及其机制，为源于双丹口服液的分子中药新药二次开发提供实验依据。2方法2.1建立同时测定双丹口服液中主要有效成分Sal B及Pae含量的方法：采用HPLC法测定双丹口服液中Sal B和Pae的含量，色谱条件为色谱柱SinoChrom ODS-BP C18（4.6mm×250mm，5μm，Yilite），柱温30°C，检测波长280nm，流速1mL·min-1，C18保护柱，流动相采用甲醇及2%的冰醋酸梯度洗脱，洗脱条件如下：甲醇-2%冰醋酸（12∶88）12min，甲醇-2%冰醋酸（50∶50）1min内调整到甲醇-2%冰醋酸（70∶30）至到30min，进样量10μL。并对此测定方法进行了方法学考察，包括线性关系考察、精密度实验、重复性实验、稳定性实验、加样回收率实验。2.2Sal B配伍Pae对高脂诱导的大鼠动脉硬化的实验研究：高脂饮食配合灌胃丙基硫氧嘧啶建立大鼠动脉粥样硬化模型，分组给药4周后，测定大鼠的心率、血压、呼吸；血脂指标：血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A（APOA）、载脂蛋白B（APOB）；血清中氧化酶：一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量；并对主动脉血管进行了病理形态学的观察。2.3Sal B配伍Pae对离体大鼠冠状动脉收缩的影响：采用高K+溶液使冠脉去极化，使PDC通道开放，外钙内流，诱发细胞内肌浆网钙释放，细胞内钙离子浓度升高，引起冠脉平滑肌收缩，分别加入不同浓度的KCl、CaCl2溶液，观察给予Sal B配伍Pae后对其收缩的影响；Hist可与冠脉平滑肌细胞膜上的组胺受体结合，启动ROC通道，引起钙离子内流，诱发血管收缩，加入不同浓度的Hist溶液后考察Sal B配伍Pae对此种收缩的抑制作用；在无钙克氏液中加入Hist，考察Sal B配伍Pae对内钙释放所引起收缩的抑制作用，而后再加入Ca2+，考察其对外钙内流所引起收缩的阻滞作用。2.4Sal B配伍Pae对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型的保护作用及其机制：采用H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型，应用形态学观察方法，MTT检测细胞活性、Hoechst33342染色和电镜等方法考察Sal B配伍Pae对内皮细胞的保护作用，利用SYBR Green RT-PCR方法检测药物作用内皮细胞后凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表达变化；Western blot法检测内皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达。3结果3.1双丹口服液中Sal B及Pae的含量：双丹口服液中Sal B及Pae的含量分别约为12mg·mL-1及0.20mg·mL-1，所建立的含量检测方法简便可靠，峰型良好，稳定性，重现性，回收率均符合要求。3.2Sal B配伍Pae对高脂诱导的大鼠动脉硬化的影响：Sal B配伍Pae对动脉粥样硬化大鼠心率、血压、呼吸均无明显影响（P>0.05）；但能明显降低血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、丙二醛及NOS含量（P<0.05或P<0.01）、并能明显升高血清中高密度脂蛋白、超氧化物歧化酶和一氧化氮水平（P<0.05或P<0.01）；对血清中的载脂蛋白A、载脂蛋白也B有明显的调节作用（P<0.05或P<0.01）。病理组织学观察发现给药组对动脉内膜斑块，内膜增厚程度及结缔组织成分具有明显改善。3.3Sal B配伍Pae对离体大鼠冠状动脉收缩的影响：在克氏液中加入KCl的不同累积浓度，在无钙高钾的克氏液中加入CaCl2的不同累积浓度，在克氏液中加入Hist的不同累积浓度后，大鼠冠脉环均会出现量效依赖性收缩，在药物（Sal B配伍Pae）孵育后，给予同等程度的KCl、CaCl2、Hist刺激，量-效曲线均朝右下方移动，达到峰值时间延长且最大反应降低；在无钙克氏液中，Hist使标本收缩，达到峰值，CaCl2使冠脉环进一步收缩，给予药物Sal B配伍Pae后，对二相收缩均有明显的抑制作用；结果具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。3.4Sal B配伍Pae对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型的保护作用及其机制：Sal B配伍Pae含药血清组对H2O2损伤的细胞状态有所改善，并且呈剂量依赖；内皮细胞的活性效应随着培养液中Sal B配伍Pae含药血清的浓度的增加而增强，2%含药血清组与模型组相比，数据无统计学意义（P>0.05）；而4%、6%含药血清组数据具有统计学意义（P<0.01）；含药血清浓度为2%时产生增殖效应，增殖率为50.25%；浓度为4%时，增殖率为67.37%；浓度为6%时，增殖率为67.14%，数据具有统计学意义（P<0.01）；Hoechst33342染色、透射电镜结果表明Sal B配伍Pae含药血清组随着给药浓度的增加，细胞凋亡的情况逐渐改善，其中中、高剂量组大部分细胞存活状态良好；细胞中Bcl-2基因mRNA水平上升，而Bax基因、caspase-3的表达降低，与Western blot方法检测蛋白含量的结果较为一致，且数据具有统计学意义（P<0.01）。4结论采用HPLC方法测定双丹口服液中Sal B及Pae的含量及配比，并以此作为分子中药（Sal B配伍Pae）的组方依据，采用体内动物实验模型、体外组织血管模型、人脐静脉内皮细胞模型，证实了Sal B配伍Pae的抗动脉粥样硬化、扩张冠脉血管、保护血管内皮细胞的作用。其机制可能与降低血清TC、TG、LDL、MDA、NOS含量，升高HDL、SOD、NO水平，抗氧化和调节脂质代谢延缓或减轻AS形成有关；通过抑制血管平滑肌细胞外钙内流（抑制PDC及ROC通道）和抑制平滑肌细胞内钙释放来扩张冠脉血管；通过调节Bcl-2、Bax基因及蛋白的表达，抑制下游分子caspase-3的活化而起到保护血管内皮细胞的作用。综上，Sal B配伍Pae治疗动脉粥样硬化有很好的应用前景。