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谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的含硫生物活性小分子化合物,它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成,在活细胞内具有抗氧化、清除自由基、提高机体免疫力和解毒等生理功能。近年来,随着研究的不断深入,GSH在食品、保健品、医药、体育运动、动物生产等诸多领域都具有广泛的应用。全细胞生物转化具有转化效率高,催化专一性强,反应条件温和等优点,因此可以采用此法合成GSH。本论文以产朊假丝酵母(Candida utilis SZU07-01)为出发菌株,以实现GSH转化的高产量、高得率为目标进行研究,主要内容包括三个方面:首先利用基因组改组(Genome shuffling)技术选育高性能菌株,提高其胞内GSH合成酶系的表达水平;其次应用统计学方法对微生物培养条件、转化液中各前体氨基酸的比例以及转化培养环境参数进行优化;最后考察表面活性剂对酵母细胞合成GSH能力的影响及其作用机制。主要研究结果如下： ⑴对出发菌株C. utilis SZU07-01采用亚硝基胍诱变,再经过2轮Genome shuffling递归融合,并通过选择培养基(含2.0 g/L乙硫氨酸,1.2 g/L NaHSO3)进行筛选,最终获得一株GSH合成能力显著提高的菌株F2-32,经过分批发酵验证,其胞内GSH含量达到2.8％,比出发菌株提高了64.2％。为下一步利用该菌株进行全细胞生物转化合成GSH奠定了良好基础。 ⑵采用单因素试验和响应面分析等实验设计方法,对培养F2-32的种子培养基成分进行优化,以获得最高GSH转化力为目标,得出最适的种子培养基成分为:葡萄糖58.5 g/L、蛋白胨25 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO417.2 g/L、MgSO4·7H2O0.05 g/L和pH6.0。在该培养基条件下,GSH转化力平均为1.54 mg/g/h,比营养条件优化前提高了将近1倍。其次,采用正交试验设计对转化液体系中各反应物组分进行优化,得到的最优组合是:半胱氨酸20 mmol/L、谷氨酸40 mmol/L、甘氨酸40 mmol/L、MgCl2·6H2O40 mmol/L和ATP20 mmol/L,在该转化液体系下,胞内GSH产量达198.2 mg/L,比优化前提高了23.0％。最后,在培养基和转化液体系优化的基础上,通过对胞内GSH合成和糖酵解过程中的关键酶以及能量代谢物质进行分析,发现葡萄糖作为能量物质代替ATP是切实可行的,转化液中葡糖糖的最适浓度为40 g/L。 ⑶考察了六种表面活性剂在GSH转化中的作用,结果显示SDS对GSH胞外积累具有积极作用,随着SDS的增加胞外GSH含量不断上升,但GSH总量呈抛物线,当SDS添加量为0.15 g/L时,胞外GSH含量为135 mg/L,GSH总量达到最大为235 mg/L。对SDS促进GSH胞外分泌的作用机理进行了进一步分析,采用透射电镜对不同作用时间下的细胞进行观察,发现适宜的SDS浓度可以在不破坏细胞性能的情况下增加了细胞膜的通透性。通过对胞内γ-GCS的酶活进行测定,发现适量 SDS的添加提高了γ-GCS的活性,这一结果也从侧面反映了SDS的作用,即通过增加细胞膜的通透性,使GSH向胞外分泌,从而解除了胞内GSH的反馈抑制作用,增加GSH合成量。对胞内能量代谢物质水平进行分析,发现SDS对细胞的能量代谢没有显著影响。这些研究结果为进一步提高GSH生物合成能力提供了理论参考。