研究目的胰岛β细胞功能紊乱和外周组织胰岛素抵抗是糖尿病发病机制中的两个重要方面。糖尿病患者体内的长期高血糖状态可导致胰岛β细胞合成及分泌胰岛素功能受损,甚至诱导β细胞死亡,这被称之为“胰岛β细胞葡萄糖毒性”。糖尿病时的血糖紊乱主要有两种主要形式,即持续性高血糖和波动性高血糖。许多体内及体外研究已经表明长期持续性高糖可造成胰岛β细胞的胰岛素合成、分泌及基因表达受损,以及细胞死亡。但是,目前关于波动性高糖对胰岛β细胞功能毒性效应的研究尚属少见。尽管在健康个体其体内的血糖水平在生理情况下也存在和轻微的波动,但是流行病学调查发现在亚临床期和临床期的糖尿病患者体内的血糖波动的幅度和频率较正常个体更为显著。而且流行病学调查资料显示血糖变异性是糖尿病患者死亡及血管并发症的独立危险因素。有研究发现同对照组比较波动性高糖孵育可显著降低鼠胰岛β细胞系INS-1细胞的胰岛素分泌、胰岛素含量及其基因表达。而且将体外分离的人类胰岛孵育于波动性波动高糖中,其葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能明显受损,甚至诱导胰岛β细胞发生凋亡。但是波动性高糖造成胰岛β细胞毒性影响的可能潜在机制目前尚知之甚少。随着对胰岛β细胞葡萄糖毒性研究的不断深入,有越来越多不同的机制和通路被证实与长期高糖损伤胰岛β细胞功能有着密切的关联,其中内质网应激和氧化应激是目前此领域中的研究热点之一。内质网是胰岛β细胞中的一个非常重要的细胞器,在多种细胞生物功能中发挥着作用,例如胰岛素原的合成,翻译后的折叠修饰,维持细胞内钙离子稳态等。许多生理性或生化性刺激可导致内质网功能紊乱,诱导内质网应激。胰岛β细胞含有丰富的内质网系统,易受到内质网应激的损伤。在生理情况下,适度的内质网应激可参与调节胰岛β细胞合成及分泌胰岛素,保持体内的血糖稳态。但是长期高糖环境可诱导过度的和(或)长时间的内质网应激,产生毒性效应,导致胰岛β细胞功能紊乱。例如内质网应激反应中的胰腺内质网应激激酶-真核细胞翻译起始因子2α(PERK-eIF2α)通路过度活化可通过诱导其下游因子如活化转录因子4(ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达,从而导致胰岛β细胞功能受损及凋亡。此外,研究亦发现大鼠胰岛β细胞胰岛素含量和基因表达降低与内质网应激反应中另一条通路——肌醇需要酶(IRE1)信号分支过度激活密切相关。但是在波动性高糖状态下,胰岛β细胞中的内质网应激反应是否也被过度激活,进而恶化胰岛β细胞功能损伤,关于此类研究目前尚属少见。此外,胰岛β细胞中由于相对缺乏抗氧化酶,故对氧化应激亦十分敏感。现认为氧化应激是导致胰岛β细胞葡萄糖毒性发生发展中的一个重要机制。体内及体外研究证实长期血糖升高可显著增加胰岛β细胞中的活性氧簇(ROS)的生成,升高氧化应激因子如丙二醛(MDA)、硝基酪氨酸、8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)等水平。ROS可通过影响胰腺十二指肠同源盒-1(PDX-1)基因表达及活性,诱导解偶联蛋白2(UCP-2)表达,介导细胞凋亡等多种途径最终导致了胰岛β细胞功能受损。然而,波动性高糖是否也可明显诱导胰岛β细胞中氧化应激,造成胰岛β细胞功能紊乱,关于此类研究报道目前较少见。因而,为探讨波动性高糖对胰岛β细胞功能的毒性效应以及可能性机制,本就采用大鼠胰岛及β细胞系INS-1细胞,将其孵育在波动性高糖环境中72h,随即观察大鼠胰岛及INS-1细胞的胰岛素合成及分泌功能变化,以及细胞内氧化应激与内质网应激标志物水平的改变,如eIF2α、PERK、ATF4、CHOP、ROS、8-OHdG以及硝基酪氨酸等。研究方法采用Ficoll-400梯度离心法在体外分离SD大鼠的胰岛。将分离的大鼠胰岛及INS-1细胞随机分为3组并孵育在含不同浓度葡萄糖的培养基中,即11.1mmol/l葡萄糖(对照组);25.0mmol/l葡萄糖(持续高糖组);11.1和25.0mmol/l葡萄糖(交替孵育,波动性高糖组),共72小时。随即应用放射免疫学方法检测大鼠胰岛及INS-1细胞的胰岛素释放功能及细胞内胰岛素含量。采用实时定量PCR分析方法测定胰岛和INS-1细胞中insulin和PDX-1基因表达,以及内质网应激指标如ATF4和CHOP基因表达。Western Blot方法被用于检测细胞内内质网应激因子eIF2α和PERK蛋白的磷酸化水平。此外,细胞内ROS水平以及氧化应激水平的指标如8-OHdG和硝基酪氨酸的含量也被测定。最后,采用MTT分析方法评价了大鼠胰岛和INS-1细胞的细胞活性。研究结果①经过72h孵育后,同对照组比较持续性高糖组大鼠胰岛和INS-1细胞的胰岛素分泌指数分别降低了39.4%和17.2%(P＜0.05),而在波动性波动高糖组分别降低了58.0%和42.2%(P＜0.05)。而且随着孵育时间的延长,同对照组相比,持续性高糖组中大鼠胰岛和INS-1细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能是逐渐减低的,此种时间依赖性的降低趋势在波动性波动高糖组尤为显著。提示波动性高糖造成的大鼠胰岛和INS-1细胞的胰岛素分泌功能损伤较持续性高糖更为严重。②经过72h持续性高糖刺激后,大鼠胰岛和INS-1细胞中胰岛素含量较对照组分别减低了26.6%和38.3%。而在波动性波动高糖组分别降低了30.6%和34.8%,两个高糖组之间无显著差别。而且通过实时定量PCR检测也发现,同对照组比较,持续性高糖组胰岛和INS-1细胞中insulin基因表达分别降低了30.7%和38.6%(P＜0.05),PDX-1基因表达分别降低了31.6%和32.0%(P＜0.05)。而在波动性波动高糖组胰岛和INS-1细胞中insulin基因表达分别降低了27.3%和33.8%(P＜0.05),而PDX-1基因表达分别减低了38.6%和33.8%(P＜0.05)。尽管持续性和波动性高糖组与对照组相比均明显降低,但两者之间无统计学差异。提示经过72h刺激后波动性高糖和持续性高糖所造成的胰岛β细胞中胰岛素合成功能损伤是相类似的。③同对照组相比,持续性高糖组中INS-1细胞中的磷酸化eIF2α和PERK水平分别升高1.7倍和2.1倍(P＜0.05),而在波动性波动高糖组二者的磷酸化水平分别升高2.5倍和5.3倍(P＜0.05),提示波动性高糖较持续性高糖更能升高eIF2α和PERK磷酸化水平。进而采用实时定量PCR方法测定了PERK-eIF2α通路的下游因子ATF4及CHOP的基因表达,发现持续性高糖组中大鼠胰岛和INS-1细胞中ATF4基因表达较对照组分别升高1.56倍和1.39倍,CHOP基因表达分别升高1.73倍和1.93倍(P＜0.05)。而在波动性波动高糖组胰岛和INS-1细胞中ATF4基因表达较对照组分别升高2.82倍和2.22倍,CHOP基因表达分别升高2.36倍和2.48倍(P＜0.05)。此结果表明波动性高糖较持续性高糖更能刺激大鼠胰岛和INS-1细胞中内质网应激反应的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路的活化。④为评价细胞内氧化应激水平,测定了大鼠胰岛和INS-1细胞中ROS水平,并将8-OHdG和硝基酪氨酸作为标志因子进行检测。进过72h孵育后,持续性高糖组中大鼠胰岛和INS-1细胞中ROS水平分别增高了45.67%和44.87%,8-OHdG水平分别升高了3.92倍和2.01倍,而硝基酪氨酸含量在胰岛和INS-1细胞中分别升高1.66倍和1.30倍(P＜0.05)。同对照组比较,波动性波动高糖组的胰岛和INS-1细胞中ROS水平分别升高了117.06%和88.01%,8-OHdG水平分别升高6.39倍和2.83倍,而硝基酪氨酸水平分别升高2.83倍和1.89倍(P＜0.05)。此结果提示经过波动性高糖刺激后胰岛和INS-1细胞中的氧化应激水平较持续性高糖显著增加,即波动性高糖更能有效诱导胰岛β细胞中氧化应激活化。⑤采用MTT染色方法检测大鼠胰岛和INS-1细胞的细胞活性发现,同对照组比较持续性高糖培养72h后大鼠胰岛和INS-1细胞的细胞活性分别减少了27%和20%(P＜0.05)。而波动性波动高糖刺激可分别降低胰岛和INS-1细胞的细胞活性35%和26%(P＜0.05)。尽管波动性高糖组较持续性高糖组的细胞活性似乎有轻微降低,但是二者之间无统计学差异。提示大鼠胰岛和INS-1细胞经过持续性和波动性高糖孵育后其细胞活性降低无显著性差别。结论及意义综上所述,本研究结果表明同持续性高糖相比,波动性高糖更容易造成严重的大鼠胰岛和INS-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能损伤,而且此毒性效应是时间依赖性的。此外波动性高糖可导致胰岛素含量、insulin及PDX-1基因表达以及细胞活性的降低。上述的胰岛β细胞功能损伤可能与波动性高糖导致的过度内质网应激和氧化应激密切相关。目前,对于胰岛β细胞葡萄糖毒性的概念一般被限定于长期持续性高糖所造成的胰岛β细胞功能损伤及细胞死亡。本研究发现波动性高糖亦可损伤胰岛β细胞合成及分泌胰岛素功能,甚至较持续性高糖更为严重。这有助于对胰岛β细胞葡萄糖毒性的发生发展机制进一步理解和认识。此外,本研究还发现波动性高糖可明显升高胰岛β细胞中的内质网应激和氧化应激水平,从而进一步阐明了波动性高糖损伤胰岛β细胞功能的可能潜在机制。在临床上,糖尿病患者体内的血糖波动往往是被忽视的一个重要方面。本研究提示此种波动性高糖其实是一种更为严重的损伤因素,这不仅可引起临床医护人员和患者自己对血糖波动的重视,而且可为糖尿病的临床治疗提供新的启示和思路。