MicroRNA（miRNA）是在真核生物中发现的一类内源的具有调控功能的非编码小RNA，可通过与靶mRNA的互补在转录后水平或翻译水平上介导靶基因的沉默，在动植物的生长发育方面发挥着重要的作用。许多研究表明miRNA基因为classⅡ基因，即由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，在miRNA的上游启动子区存在许多已知的转录调控核心元件如TATA-box、CT-repeat以及CpG岛等。另外，在一些胁迫相关的植物miRNA的上游调控区也能发现一些已知的响应胁迫的元件。分析miRNA的启动子是辅助研究miRNA的一个重要方法，对揭示miRNA的功能有重要的意义。　　 在动物或植物的不同物种中许多miRNA在进化上都是保守的，多条不同的前体序列经过加工可以产生相同或相似的miRNA成熟序列，在同一物种中miRNA基因以orthologs存在，而在不同物种中以homologous存在，这些miRNA位点便被划归到同一个miRNA基因家族中。miRNA的这种高度的保守性被认为与其功能的重要性有密切关系。在植物中，miRNA基因大部分都是分离的、独立的转录单位。在拟南芥和水稻中，大约有50％的植物miRNA来源于基因组上的多个位点，形成多基因miRNA家族。在同一miRNA家族中，即使不同的前体会产生相同或相似的miRNA成熟序列，由于上游调控序列不同，其在时空表达模式上也会产生差异，可能调控不同的靶基因。所以，研究miRNA家族的表达模式有助于了解一个miRNA家族所参与的调控网络，对阐释其功能有重要的意义。　　 植物mir169家族是一个古老而保守的大家族，它不仅在单子叶和双子叶植物中保守，在古老的裸子植物和蕨类植物中也能找到其同源序列。据最新的miRBase数据库统计，mir169已在包括拟南芥、水稻、蓖麻等15种被子植物中发现。家族庞大、编码的基因位点多是该家族的一个主要特点。研究表明mir169家族的成员广泛参与到了调控植物生长发育以及对环境胁迫的响应中，其功能的多样化与其家族的庞大有密切关系。　　 拟南芥基因组可编码14个mir169成员，是拟南芥中最大的miRNA家族，分布在4条染色体上，其中包括位于Ⅲ号染色体上的三个串联排列的miRNA基因对，基因对中的两个成员由同一条上游启动子序列所调控。这14个成员最终可加工成4条成熟序列，它们仅在5’和3’末端的一两个核苷酸位置有差异。为了更好地理解mir169的功能及其参与的调控过程，我们首先对其家族成员的表达模式进行了具体的分析。我们克隆了mir169家族的11条启动子序列，在其下游连上GUS报告基因，转化拟南芥，对纯合的转基因植株在不同时期和不同组织器官中进行GUS染色，以确定mir169的表达模式。研究发现mir169整个家族的表达有以下特点：（一）表达复杂多样，具有组织特异性和时空特异性；（二）少数家族成员的表达比较特异，比如mir169a，mir169c以及mir169k1和mn等，多数成员的表达是冗余或部分冗余的，许多都倾向于在维管组织中表达；（三）mir169e和h的表达丰度最高，在幼苗期和成熟期都有表达，mir169e的表达范围最广，在根、茎、叶、花和果荚中都能检测到其表达；用GUS染色分析和RT-PCR的方法都没有检测到mir169g的表达，推测其可能为假基因；其余成员则主要在幼苗期表达，在成熟时期的表达量消失或下降。　　 另外，分析结果表明，mir169ij，k1和mn的表达模式有很大程度的重叠。用不同的工具对它们的上游启动子区进行序列分析发现，三者的上游调控区有很高的相似性，并且共有许多基序和调控元件，合理地解释了它们冗余的表达模式。另外，据本实验结果推测，三个基因对的上游调控区之所以序列相似是因为它们在串联复制的时候其上游的一段启动子区也同时发生了复制。　　 为了研究mir169家族成员是否响应逆境胁迫，我们还对转基因植株进行了胁迫处理，结果发现，一部分mir169成员明显的受到了ABA以及高温的调控。一致的是，在这些家族成员的启动子区同时也发现了许多响应ABA的ABRE元件和响应高温的HSE元件，说明mir169可能参与调控植物对这两种环境因子的适应性。　　 通过miRU分析，我们预测了mir169家族的9个靶基因，其中7个为NFYA核转录因子家族的成员。经过RT-PCR和Genevestigator数据库分析发现，这些靶基因的表达模式在某些组织和某些时期与mir169的表达模式相反，表明它们可能受到了mir169的调控。为了更好地验证mir169对这些靶基因的调控，我们超表达了mir169a，mir169c，mir169g和mir169m的前体序列，分别代表mir169家族四种不同的成熟体。在这四种超表达植株中验证9种靶基因的表达，结果发现，除了Atlg70700（编码一种JAZ9蛋白）表达没有明显变化外，其他的靶基因都受到了不同程度的调控，并且不同的成熟序列对同一个靶基因的调控效率也有差异，说明这种调控效率可能与mir169与靶基因的互补性有关系。　　 我们对其中的一个靶基因AtNFYA1进行了初步的功能研究。利用洋葱表皮进行的瞬时表达实验证实AtNFYA1特异性地定位于细胞核中，符合其作为转录因子的特征。将其在拟南芥中进行超表达，发现超表达植株表现出了一系列发育表型的变化，包括叶片卷曲、株型变小以及开花延迟等。在ABA、盐、干旱以及甘露醇等胁迫条件处理下，NFYA1的表达受到了明显的上调。对NFYA1超表达植株进行胁迫处理，发现其表现出了明显的耐盐性。之后用microarray对超表达植株进行表达谱分析发现许多参与调控发育过程、激素途径以及胁迫响应的基因都发生了差异表达，说明这些基因可能受到了NFYA1的调控。用PLACE软件分析发现，许多差异表达的基因上游都存在NFY转录因子的结合位点CCAAT-box，说明NFYA1可能通过直接调控某些基因的表达从而参与调控植物的生长发育以及胁迫耐受性。