背景：信息的储存、处理和再现是人类赖以生存的重要技能。近些年,人们对认知过程的分子细胞学机制理解有了很大进展,为治疗记忆类疾病和缓解人类衰老导致的认知能力降低提供了新靶点、新思路。通过动物模型研究学习记忆的分子机制发现了参与此过程的一系列分子,其中的一个重要分子就是脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)。BDNF是神经营养素家族的成员之一,广泛分布于神经系统,并在其发育过程中起到维持和调控神经元存活、分化以及突起生长的重要作用。研究表明,BDNF除了在神经系统发育这一特定时期具有重要的营养作用外,还通过其高亲和力酪氨酸激酶受体B (TrkB)参与长时程增强(Long term potentiation, LTP)的诱导、维持以及突触结构修饰等突触可塑性变化,并且参与多种学习记忆的过程,如Morris水迷宫、放射迷宫、场景性恐惧条件记忆和被动回避学习后,海马中BDNF mRNA的表达快速升高,提示BDNF的基因转录与学习记忆过程密切相关。而作为一种分泌蛋白,BDNF必须从神经元内释放出来与其受体结合才能发挥其生物学功能。研究表明,BDNF第66位的氨基酸残基由Val突变为Met后BDNF调节性分泌降低,流行病学调查研究发现此种基因变异与记忆力降低、抑郁症、早老性痴呆、双相情感障碍等疾病有关。但目前还没有直接证据证实神经元活性依赖的BDNF可调节性分泌在学习记忆不同过程中的作用。而且以往BDNF调控学习记忆中的研究都是集中在单独的脑区内进行,大脑结构的复杂性在于脑内不同的核团间有千丝万缕的纤维联系,形成许多神经环路,很少看到在神经环路水平研究BDNF调节学习记忆的论文。条件性味觉厌恶(conditioned taste aversion, CTA)是一种经典的条件反射,具体表现为动物在摄取某种具有新异味觉的食物(条件刺激,conditioned stimulus (CS))后,伴随有后续的内脏不适(如恶心、呕吐、腹泻等,非条件刺激,unconditioned stimulus (US)),动物便可较长时间“记住”这种食物的特殊味觉特征,今后将减少或拒绝摄取相同味觉特征食物的过程,可以用来研究记忆的不同过程,如获得(acquisition)、整合(consolidation)、再现(retrieval)、消退(extinction)等。最重要的是CTA记忆的神经环路较为清楚,神经解剖学的研究发现,传递味觉和内脏感觉的神经纤维在岛叶(Insular cortex,IC)、杏仁体基底外侧核(basal lateral nuclei of amygdala, BLA)、杏仁体中央核(central nuclei of amygdala, CeA)、丘脑、臂旁核及孤束核等部位交汇,提示以上脑区可能是CTA记忆的关键脑区,脑区定向毁损及药理学干预等研究也对此进行了证实。本课题定位于多个与CTA形成和消退相关脑区,采用动物行为学,脑内埋管给药,Real-time PCR、IP、western-blot等分子生物学研究方法,系统的研究CTA记忆形成过程中活性依赖的BDNF分泌及合成在特定脑区的特异性调节作用以及记忆消退的神经环路机制。通过本课题的研究,能使我们进一步了解BDNF/TrkB参与CTA记忆的神经生物学机制,更可为将来以BDNF/TrkB为目标的CTA记忆干预提供新思路和新方法。目的：1.探讨脑区特异性BDNF分泌及合成在CTA记忆形成中的作用。2.探讨BDNF信号调节CTA记忆消退的神经环路机制。方法：1.条件性味觉厌恶(conditioned taste aversion, CTA)记忆形成和消退CTA记忆形成：可分为三个阶段：适应期、训练期和测试期。具体过程如下：适应期3天,每天在固定时间给予自来水,使动物养成在固定时间饮水的习惯。训练期,即第4天时将自来水换成糖水,并在大鼠饮糖水40分钟后腹腔注射LiCl制造动物腹部不适,建立条件刺激(糖水)和非条件刺激(腹部不适)间的耦联。测试期,即训练期后4h或72h(分别检测短时记忆和长时记忆),同时给予糖水和自来水,计算动物饮自来水量占饮液体总量的百分比作为厌恶指数。厌恶指数越高,说明CTA记忆形成得越好。CTA记忆消退：即在测试期开始后每天都给予动物糖水和自来水,但不给LiCl注射,连续6天,每天计算厌恶指数,会发现动物的厌恶指数逐渐降低,说明经过消退训练后动物逐渐“忘却”了这种厌恶记忆。2. Real-time PCR在CTA记忆形成和消退的特定时间点,将大鼠断头取脑,迅速分离所需脑组织提取RNA并测浓度,同时用凝胶电泳及分光光度计的OD260/280比值判断RNA质量,将质量合格的RNA做反转录,最后做实时定量PCR检测内参actin及目的基因,并用2-△△CT方法统计目的基因的变化情况。3.原位杂交大鼠训练完毕后灌流取脑,于蔗糖中沉淀>3天,冰冻切片机切片厚度为40um,每个脑区取6套组织切片,经透化、洗涤、预杂交、杂交、显色反应,最后用Image J软件统计各脑区灰度值,各脑区的实际灰度值=该脑区的灰度值-同一切片中未杂交的背景灰度值,如胼胝体。4.免疫沉淀在CTA记忆形成的特定时间点,将大鼠断头取脑,迅速分离所需脑组织提取蛋白并测浓度,按5mg计算每个样品的体积,并加入protein A beads润洗离心后,在上清中加入兔抗TrkB抗体(Millipore,1:100)摇3h,按20：1的比例加protein A beads,4°摇过夜,离心并洗涤完毕后将蛋白变性,待电泳、转膜及封闭完毕后,分别加入抗磷酸化酪氨酸抗体pY99(Santa Cruz, Califonia,1:4000)及小鼠抗TrkB抗体(BD,1：1000)检测磷酸化TrkB及总TrkB。其中对照组磷酸化TrkB与总TrkB的灰度比值设为1,其余各组磷酸化TrkB与总TrkB的比值根据对照组的灰度比值标准化后与其比较。5.脑内埋管药物干预将雄性Wistar大鼠(250-280g)麻醉后固定于脑立体定位仪,以前囟点为原点,根据不同的坐标双侧脑内埋管至特定脑区。手术恢复一周后开始行为学实验。根据不同的研究目的选择在不同的时间点微量注射药物,观察动物行为学有无缺陷。6.免疫组化大鼠注射BDNF90分钟后,灌流取脑,冰冻切片40um,每个脑区取6套组织切片,经10%山羊血清封闭2小时后,加入c-fos (Santa Cruz,1:750)及Neun (Millipore,1:500)的一抗,4度孵育过夜后,分别用488和594标记的二抗室温孵育1小时。并对实验组和对照组c-fos表达阳性的神经元占总神经元的百分比进行比较。结果：1.脑区特异性BDNF分泌及合成在CTA记忆形成中的研究1.1CTA记忆形成诱导时空特异性BDNF表达变化CTA训练后特定时间点快速取脑切片分离出特定脑区,用Real-time PCR和Elisa检测BDNFmRNA、BDNF同家族成员神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和神经营养素-4(NT-4)的mRNA及BDNF蛋白的表达变化。我们发现CTA训练后,CeA和IC中的BDNFmRNA及蛋白出现了不同程度的升高,而且BDNF蛋白水平升高稍落后于mRNA的变化,其他脑区如BLA、vmPFC和HIP中BDNF的表达水平在CTA训练后没有变化；而且这种表达变化是BDNF特异性的,NGF和NT-4mRNA的表达水平在CTA训练后没有变化。为了确认取材部位的准确性,我们进一步通过原位杂交对Real-timePCR的结果加以验证。另外,为了确认BDNF的表达变化是CTA条件性学习诱导的,我们设立了不同的行为学对照,以观察BDNF的表达变化是否是CTA学习记忆诱导的,结果发现BDNF的“时空”表达变化是由于CTA训练过程中CS和US的耦联学习诱导的,并不是CS或US单独的作用。1.2CTA记忆形成诱导特定脑区BDNF的释放BDNF需要从神经元胞内释放出来后与TrkB受体结合,诱导TrkB受体磷酸化并激活下游一系列信号,才能发挥相应的生物学功能。在CTA训练后我们通过TrkB免疫沉淀结合pY99Western blot的方法检测TrkB的磷酸化水平。结果发现CTA训练后1小时(BDNF mRNA和蛋白水平都没有增加)CeA和IC中的TrkB磷酸化水平已经明显升高并维持到CTA训练后8小时(BDNF蛋白水平增加达到高峰)。在BLA和vmPFC脑区,TrkB磷酸化水平没有变化。这些结果提示在CTA记忆形成过程中,TrkB磷酸化升高的区域特异性与BDNF表达变化的区域特异性一致,但是TrkB磷酸化增加早于BDNF合成增加,说明CTA记忆形成过程首先诱导的是BDNF的分泌释放,然后出现BDNF合成增加。1.3CeA中BDNF分泌与合成增加在CTA记忆形成中的作用为了进一步探讨不同脑区BDNF在CTA记忆形成中的作用,我们首先用脑内埋管微量注射Trk受体抑制剂K252a的方法,发现CeA和IC中抑制Trk受体磷酸化后,CTA短时记忆(short term memory, STM)及长时记忆(long term memory, LTM)均受到不同程度的损伤。为了更特意的研究BDNF分泌及合成增加在CTA记忆形成中的作用,我们在CeA核团内埋管分别注射BDNF反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)或BDNF抗体。我们发现注射BDNF ASO阻断了CTA训练后BDNFmRNA的表达增加和训练后8小时时间点TrkB磷酸化水平的升高,但却不影响CTA训练后1小时时间点TrkB磷酸化的增加,提示BDNF ASO注射可以阻断BDNF表达增加,但却不影响BDNF的分泌。另一方面,在CeA注射BDNF抗体后1小时和8小时时间点TrkB磷酸化的增加都被阻断了,提示注射BDNF抗体可以中和分泌的BDNF,阻止BDNF和TrkB结合,从而阻断BDNF的生物学作用。行为学结果发现,CeA中注射BDNF ASO不影响CTA STM,但损害CTALTM；而BDNF抗体注射同时干扰了CTA的短时和长时记忆。这解释了目前文献关于BDNF参与调控记忆获得和整合过程中矛盾的报道。我们进一步的实验在CTA训练后1小时再在CeA中注射BDNF抗体,发现不影响短时记忆,却干扰了长时记忆的形成,这进一步证实CeA中BDNF分泌参与记忆获得,而BDNF合成参与了记忆的整合。另一个有意思的现象是,CeA中注射BDNF抗体后也阻断了CTA训练诱导的BDNFmRNA合成增加,提示分泌的BDNF激活TrkB受体后能诱发一个“正反馈”的信号通路刺激BDNF合成增加。1.4CeA内注射重组BDNF能够增强CTA记忆我们发现在CTA训练过程中给予一个较弱的非条件刺激后导致形成的记忆减弱,伴随着TrkB磷酸化和BDNF合成降低；在这种弱训练后CeA内注射重组BDNF能够增强TrkB的磷酸化和强化CTA记忆形成。2. BDNF信号调节CTA记忆消退的神经环路机制2.1CTA记忆消退诱导特定脑区BDNF表达变化CTA消退训练的第二天测试完毕后不同时间点取脑,用Real-time PCR和Elisa检测BDNF mRNA、NT-4mRNA及BDNF蛋白水平的变化。结果发现BLA和IL中的BDNFmRNA及蛋白出现了不同程度的升高,并且BDNF蛋白的增加要晚于mRNA的变化。另外,我们还发现这种表达变化是BDNF特异性的,BDNF的家族成员NT-4的表达水平在CTA消退训练后没有变化。我们进一步通过原位杂交的方法验证了Real-time PCR的结果。这些结果提示CTA记忆消退过程中各关键脑区内BDNF表达也有其“时空”变化规律,并且与记忆获得过程中的变化规律有所不同。2.2IL及BLA中BDNF参与CTA记忆消退为了进一步研究不同脑区BDNF在CTA消退中的作用,我们首先用脑内埋管微量注射K252a阻断Trk受体的方法,发现IL及BLA中注射K252a后与溶剂对照组相比CTA消退明显延迟。为了更特意性的研究BDNF的作用,我们选择在IL及BLA注射BDNF抗体,结果同上。提示IL及BLA中的BDNF在CTA消退过程中起着重要作用。另外,我们还发现在BLA中注射BDNF抗体后1.5小时取脑,Real-time PCR结果显示IL中BDNF表达不再增加,说明BDNF可能通过BLA-IL的神经环路参与CTA记忆消退。我们发现在CTA消退训练过程中在IL或BLA注射重组BDNF能够促进CTA记忆消退。2.3IL中注射BDNF抗体能够阻断BLA注射重组BDNF导致的快速消退大脑结构的复杂性在于脑内不同的核团间有千丝万缕的纤维联系,形成许多神经环路,神经束路追踪研究表明BLA与vmPFC之间有密切的纤维联系,为了在神经环路的水平上研究BDNF/TrkB通路在CTA记忆消退中的作用,我们首先用免疫组化的方法观察在IL及BLA中分别注射BDNF后BLA及IL中神经元c-fos的变化,结果发现BDNF能够通过BLA-IL环路激活神经元。为了进一步验证在CTA消退过程中BDNF作用的神经环路机制,我们将实验分为3组：在BLA注射BDNF抗体后立即在IL注射BDNF组(IL BDNF+BLA BDNF antibody),在IL注射BDNF加BLA注射溶剂对照组(IL BDNF+BLA Vehicle)和在IL及BLA均注射溶剂对照组(IL Vehicle+BLA Vehicle)。结果发现,1L BDNF+BLA Vehicle组加速了CTA消退,而IL BDNF+BLA BDNF antibody组与IL BDNF+BLA Vehicle组相比没有差异。接下来我们将实验组分为：在BLA注射BDNF后立即在IL注射BDNF抗体组(BLA BDNF+IL BDNF antibody),在BLA注射BDNF加IL注射溶剂对照组(BLA BDNF+IL Vehicle)和在IL及BLA均注射溶剂对照组(IL Vehicle+BLA Vehicle)。结果发现,BLABDNF+IL Vehicle组加速了CTA消退,而在BLA打BDNF的同时在IL注射BDNF antibody则阻断这种促消退作用。说明,在CTA消退过程中BDNF信号是从BLA传到IL结论：1.CTA训练能够增加IC及CeA中BDNF的分泌和合成,并且BDNF的分泌要早于BDNF的合成,而对BLA及vmPFC中的BDNF表达没有影响。2.CeA中活性依赖的BDNF释放和合成分别参与CTA记忆的获得和整合过程。3.在CeA给予重组BDNF能够加强CTA记忆的形成。4.CTA消退训练能够增加IL及BLA中BDNF的表达,而对于CeA中的BDNF没有影响。5.CTA记忆消退过程中BDNF信号是从BLA传到IL的。意义：本课题的研究将使我们进一步明确活性依赖的BDNF分泌及合成在记忆不同过程中的作用；并为在神经环路水平进一步了解BDNF在学习记忆过程中的作用提供重要帮助。