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目的及意义DNA双链断裂(double-strand break, DSB)是DNA在受到各种损伤因素作用后最严重的损伤方式之一,可导致基因变异或细胞死亡。DSB发生时,机体可通过同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous DNA end joining, NHEJ)两条途径对其进行修复,而后者是高级哺乳动物修复DSB的主要途径,Ku70是其核心因子之一。本研究拟从基因转录水平和蛋白水平检测慢性粒细胞性白血病(Chronic myeloid leukaemia,CML)Ku70在初诊CML患者细胞中的表达,并对Ku70和BCR/ABL融合基因表达水平进行相关性分析,以探讨Ku70表达及NHEJ在CML发病中的作用,为阐明CML的确切发病机制提供新的线索。方法1. Ficoll分离初诊CML各期患者及正常供体骨髓单个核细胞,取2×107个单个核细胞用于后续实验。2. RT-PCR和实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)检测初诊CML细胞和正常供体骨髓细胞中Ku70基因在转录水平的表达。3. RQ-RT-PCR检测初诊CML细胞中BCR/ABL融合基因在转录水平的表达。4. Western Blot印迹法检测初诊CML和正常供体骨髓细胞Ku70蛋白的表达。以Ku70与内参TBP(TATA Box Binding Protein)的灰度比对Ku70蛋白的表达水平进行半定量分析。5.采用SPSS13.0分别分析以下因素之间的相关性:(1)初诊CML中BCR/ABL与Ku70在转录水平的表达量;(2)初诊CML中BCR/ABL mRNA与Ku70蛋白的表达量;(3) Ku70在转录与蛋白水平的表达量。结果1. RT-PCR检测Ku70基因转录的表达:24例正常供体骨髓细胞中几乎看不到Ku70基因mRNA的表达;CML各期细胞中的Ku70基因表达均明显高于正常对照组,同时12例CML急变加速期细胞中Ku70基因的表达也明显高于CML慢性期。2. RQ-RT-PCR检测Ku70基因转录的表达:CML各期细胞中Ku70基因的表达量(544.63±185.71 Ku70拷贝/10000β-Actin拷贝)显著高于正常对照组(31.08±8.41,P=0.039),同时CML急变加速期细胞中Ku70基因的表达量(1103.31±645.62)远高于正常对照组和CML慢性期细胞(97.69±40.73,P<0.01),而慢性期细胞中Ku70基因的表达与正常细胞之间的差异无统计学意义(P>0.05)。3. Western Blot印迹法检测Ku70蛋白的表达:24例正常供体骨髓细胞中Ku70蛋白与TBP灰度比为(0.10±0.09),27例CML细胞中为(0.40±0.21),明显高于前者(P<0.001)。其中,12例急变加速期CML细胞为(0.57±0.22),15例慢性期CML细胞为(0.27±0.04),二者之间差异有统计学意义(P<0.001)。4.相关性分析结果:(1)初诊CML各期细胞中BCR/ABL融合基因与Ku70基因在mRNA水平的表达呈正相关关系(r=0.573,P=0.002);(2)初诊CML各期细胞中BCR/ABL融合基因表达与Ku70蛋白表达呈正相关关系(r=0.705, P<0.001);(3) Ku70基因在mRNA和蛋白水平的表达亦呈显著的正相关性(r=0. 808, P<0.001)。结论1. CML各期细胞中Ku70基因的表达高于正常对照组,提示以Ku70为核心因子的NHEJ修复途径在CML中被过度激活。2. CML急变加速期细胞中Ku70基因在mRNA和蛋白水平的表达量均远高于正常对照组和CML慢性期细胞,而慢性期细胞中Ku70在mRNA和蛋白水平的表达与正常细胞间无显著差异。提示NHEJ途径的过度激活在CML自慢性期向急变加速期的演变过程中发挥了重要的作用。3. CML细胞中Ku70基因和蛋白的表达与BCR/ABL融合基因的水平呈正相关性。说明CML细胞中BCR/ABL融合基因的高表达与NHEJ途径过度激活呈相同趋势,提示在CML细胞中BCR/ABL的表达与NHEJ途径修复DSB密切相关。4.在CML细胞中Ku70基因与Ku70蛋白的表达量呈正相关性,说明在CML细胞中Ku70在mRNA和蛋白水平表达量的变化是同步的,提示CML细胞通过NHEJ修复DSB可能同时发生在基因水平和蛋白水平。