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纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。天然微生物产生的纤维素酶活力不够高,生产成本较高。通过基因工程手段,提高纤维素酶的活性是降低纤维素酶生产成本的一个有效途径。
根据国际基因库(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,序列分析发现该基因无内含子,故直接以提取的米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增得到一条1200bp左右的特异条带,连接到pMD19-T-simple上。测序表明,其长度为1251bp,OFR为1251bp,编码417个氨基酸,5’端有一个编码17个氨基酸的信号肽序列,其全长理论分子量为44.46KDa,序列比对发现与参考的内切葡聚糖酶基因序列相似性高达100％。将内切葡聚糖酶基因eg在GenBank中注册,登录号为Accession No.HQ739052。
以克隆的内切葡聚糖酶基因eg为基础,将eg定向插入到大肠杆菌表达载体pET32a上,得到重组表达质粒pET32a-eg,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,水解圈筛选结果表明已成功表达。
以克隆的内切葡聚糖酶基因eg为基础,将eg定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,将pPICZαA-eg线性化后电转化酵母宿主菌X33感受态细胞获得大量阳性转化子,水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65KDa。在摇瓶培养条件下,对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件的优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75％,用1L三角瓶诱导培养五天达到最高酶活120U/mL。
对原始酶与重组酶的酶学性质比较发现,原始酶的最高酶活可达250U/mL,重组酶的单位酶活力为120U/mL,原始酶的最适pH和温度分别为4.0和55℃,在45℃-65℃和pH3.4-4.4范围内可保持内切葡聚糖酶最高活力80％以上。重组酶的最适pH和温度分别为4.0和45℃,在35℃-45℃和pH3.4-4.4范围范围内可保持内切葡聚糖酶最高活力80％以上。