不结球白菜叶发育基因BrLOM2的克隆与功能分析

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不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis),原产中国,是长江流域及其以南地区大量种植,分布最广,种类最多的芸薹属蔬菜作物之一。不结球白菜存在三个变种:普通不结球白菜,乌塌菜和菜薹,品种的多样性使得不结球白菜存在多种不同的叶形。叶的形态影响不结球白菜对环境的适应性及其商品价值,选择性状优良,提供满足市场需求的不结球白菜是生产实践过程重要的环节,但目前对不结球白菜叶发育机理的研究较少。本研究利用RNA-Seq技术分析了不结球白菜圆叶、裂叶近等基因系差异表达基因(DEGs),发掘参与不结球白菜叶发育的候选基因;克隆了其中一个候选基因BrLOM2,分析了其时空表达特性及对激素的响应;通过转基因技术探索了BrLOM2基因在叶发育过程的功能。主要得到以下结果:1.应用RNA-Seq技术从mRNA水平发掘了圆叶不结球白菜、裂叶不结球白菜近等基因系的表达差异基因。圆叶、裂叶不结球白菜过滤掉低质量reads后分别获得54223970、54840708对高质量reads,唯一比对到参考基因组的reads比例为70.42%和70.19%,说明RNA-Seq结果及所选参考序列可靠。裂叶相对圆叶存在564个差异显著的差异表达基因(different expressed genes,DEGs),其中302个基因表达量上调,262个基因表达量下调。GO富集分析发现DEGs在生物过程功能分类中,最主要的两个生物过程是代谢过程(GO:0008152),细胞过程(GO:0009987);细胞组分功能分类中,细胞(GO:0005623)和细胞部分(GO:0044464)所占比例最高。分子功能分类中,结合(GO:0005488)和催化活性(GO:0003824)功能涉及差异基因最多。KEGG富集分析表明DEGs显著富集于11条通路,参与次级代谢途径(map01100)、植物激素信号转导(map04075)及植物病原菌的相互作用(map04626)三个途径的DEGs最多。利用RT-PCR检测了6个DEGs的表达模式,与RNA-Seq分析结果一致证实了RNA-seq结果的可靠性。对转录组数据分析获得的候选基因进行不同发育时期的表达分析,获得了7个参与叶发育的基因,分别是Teosinte Branched1,Cycloidea,and Pcf13(TCP13)(Bra001032),Decelopment-related Pcg Target In The Apex4(DPA4)(Bra009171),Lost Meristem2(LOM2)(Bra014479),Growth Regulating Factor6(GRF6)(Bra015184),Cyp79B2(Bra017871),Arabidopsis thaliana V-H+-PPase(Avp1)(Bra018135)和Late Meristem Identity1(LMI1)(Bra009510)。2.以不结球白菜圆叶、裂叶近等基因系为材料,利用同源克隆技术克隆得到BrLOM2基因,分析其时空表达特性及对激素的响应。结果显示,Br LOM2的ORF全长为549bp,编码182个氨基酸,含有GRAS家族保守结构域,可能位于细胞核中。进化分析表明,BrLOM2属于十字花科LOM2分枝,与大白菜(XP009138823.1)、甘蓝型油菜(XP013707740.1)等亲缘关系最近。BrLOM2在不结球白菜茎顶端、叶中表达量最高,根中其次,花中最低;在叶生长发育过程中,BrLOM2在圆叶不结球白菜中的表达量高于同期裂叶不结球白菜。6-BA、GA3处理后,随着处理时间的延长,BrLOM2的表达量分别呈现先下降后上升和先上升后下降的趋势。这些结果说明,BrLOM2的表达在两种叶缘形态不结球白菜中具有差异性及时空表达特异性,激素对其表达有抑制或者促进效应,暗示该基因在叶发育过程发挥着作用。3.构建了过表达载体p2301-BrLOM2和干扰表达载体pRNAi-BrLOM2,通过农杆菌介导法转化了拟南芥哥伦比亚野生型。通过Kan抗性筛选、PCR检测和表型观察鉴定得到转基因植株。
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