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研究背景白塞病(Behcet’s Disease,BD)是一种病因未明的累及多系统的慢性复发性血管炎性疾病。T细胞比例失衡在BD发病中具有重要作用。端粒是调节细胞衰老的重要物质,端粒长度和端粒酶活性参与调节细胞衰老和炎症反应。Shelterin蛋白复合体在维持端粒稳定和保护端粒DNA中发挥关键作用。研究目的本研究旨在探究shelterin蛋白复合体亚基在BD患者初始CD4+T细胞中的表达变化,并进一步阐明其表达的改变对细胞内端粒与端粒酶状态、细胞比例与功能以及DNA损伤修复分子的影响,为BD的发病机制提供新的线索。研究方法1.留取2017年11月至2019年11月就诊于北京协和医院免疫内科门诊的初治BD患者40例和年龄性别匹配的健康志愿者(healthy control,HC)40例外周血标本,同时记录BD患者的临床与实验室检查信息。2.利用流式细胞术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞和记忆CD4+T细胞比例和绝对数量,并测定初始CD4+T细胞凋亡水平(Annexin V阳性细胞比例)和衰老水平(CD57阳性细胞比例)。3.利用ELISA法测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞体外培养上清液中炎性细胞因子(IFNγ、TNFα)分泌水平。4.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞内shelterin 蛋白复合体各亚基(TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1、POT)的表达水平,并分析差异表达亚基表达水平与血沉、超敏C反应蛋白、BD当前病情活动表格(Behcet’s Disease Current Activity Form 2006,BDCAF 2006)评分和患者病程的相关性。5.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞端粒的长度。利用PCR-ELISA联合技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞端粒酶活性。6.利用western blot技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞DNA损伤修复相关分子(ATM、pATM、Mre11、Rad50、Nbs1、CHK2、pCHK2、H2AX、γH2AX、p53、pp53)的表达。7.利用实时荧光定量PCR技术测定BD患者和HC外周血初始CD4+T细胞细胞周期调控相关分子(p21、GADD45A)的表达。8.利用siRNA干扰技术敲低HC初始CD4+T细胞内TRF2的表达,检测细胞凋亡、衰老水平及p53分子的表达。研究结果1.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞比例和绝对数量显著减少,记忆CD4+T细胞比例和绝对数量明显增加(p<0.05)。初治BD患者在治疗后,其外周血初始CD4+L T细胞比例和绝对数量均无明显回升,记忆CD4+T细胞比例和绝对数量也无明显改变。2.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞凋亡明显增加,同时衰老标记CD57的表达也增加(p<0.05)。3.同HC相比,BD患者活化后初始CD4+T细胞培养上清液中促炎细胞因子TNFα表达水平明显升高(p<0.05),IFNγ表达水平有升高趋势。4.同HC相比,BD患者外周血初始CD4+T细胞中TRF2、TIN2和RAP1亚基的表达水平降低(p<0.05);TRF1、TPP1和POT1亚基的表达水平无明显变化。且差异表达的TRF2、TIN2、RAP1亚基表达水平与血沉、超敏C反应蛋白、BDCAF 2006评分和患者病程均无相关性。5.同HC相比,BD患者初始CD4+T细胞的端粒酶活性显著降低(p<0.05),且细胞活化前后,BD端粒酶活性无明显上调,HC端粒酶活性上调显著(p<0.05)。同时,BD患者初始CD4+T细胞的端粒长度(T/S比值)较HC有缩短趋势。6.同HC相比,BD患者初始CD4+T细胞内DNA损伤修复分子ATM、pATM、Mre11、Rad50的表达水平降低,Nbs1、CHK2、H2AX、p21的表达水平无显著改变,pCHK2、γH2AX、p53、pp53、GADD45A 的表达水平增加。7.经TRF2 siRNA干扰后,初始CD4+T细胞的凋亡水平较对照组细胞明显增加;培养的上清液中TNFα和IFNγ的表达水平较对照组显著升高;同时,p53分子的表达水平增加。结论BD患者初始CD4+T细胞shelterin蛋白复合体表达存在固有缺陷,同时其端粒酶活性上调系统亦存在异常,通过异常活化CHK2、H2AX、p53和GADD45A,促进T细胞的衰老与凋亡,导致机体的炎症损伤。ATM与MRN复合体分子的表达缺陷亦加重了 BD患者T细胞内DNA损伤的累积,促进细胞凋亡。利用siRNA技术敲低TRF2的表达,进一步验证了其在BD发病机制中的作用。