基于非标记适配体和金纳米酶构建赭曲霉素A可视化传感器的机理研究及试剂盒研发

来源 :西南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tq19822002
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真菌毒素引起的食品安全问题已得到世界各国的广泛关注。其中,赭曲霉素A(OchratoxinA,OTA)是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌种产生的次级代谢产物,在坚果、谷物类农产品和饲料中污染最为严重。大量研究表明OTA具有很强的肾毒性、肝毒性和神经毒性等,并且可对人和哺乳动物致畸或致癌。目前,OTA的常规检测方法存在检测时间长、仪器设备成本高、前处理步骤繁琐、对操作人员专业素养要求较高等问题。因此发展快速、准确、有效并且经济适用的安全分析方法,对保障食品安全和人类健康具有重要意义。适配体具有稳定性高、特异性强、亲和性高、批次间变异小、易于化学合成和修饰、生产成本低等优点。近年来,利用适配体为识别元件开发的生物传感器受到广大科研工作者的青睐和关注。金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)是一种重要的纳米酶材料,具有优良的催化特性,能够模拟过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等的活性,催化对应的底物发生反应。由于具有无毒、催化活性高、稳定性好等优点,AuNPs在催化检测领域受到广泛关注。本课题利用适配体的特异性识别、高亲和力和构象转变等特点和AuNPs优异的过氧化物酶性质,构建了基于适配体和金纳米酶的可视化比色传感器,实现对食品中OTA的定量检测。主要内容如下:第一部分:基于非标记适配体和金纳米酶构建OTA可视化传感器的机理研究。本章节合成了粒径为13 nm的AuNPs,首先通过TO染料荧光试验证明适配体与OTA可相互结合,紫外-可见吸收光谱和Zeta电位测定表明AuNPs与OTA不发生非特异性结合(静电吸附以及配位等作用),从而确定了基于适配体和AuNPs构建OTA可视化比色传感器的可行性。其次探究了适配体增强AuNPs酶活性的机理。Zeta电位测定表明适配体吸附在AuNPs表面后增加AuNPs的负电荷密度,有利于底物TMB的吸附。对苯二甲酸探针的荧光试验表明适配体促进·OH的生成,XPS试验表明适配体促进Au3+的释放,这些均有利于促进TMB的氧化。因此适配体表现为增强AuNPs的过氧化物酶活性。当OTA不存在时,适配体吸附在AuNPs上,AuNPs的过氧化物酶活性增强,TMB氧化产物颜色较深;当OTA存在时,适配体与OTA结合,AuNPs的过氧化物酶活性减弱,TMB氧化产物颜色变浅,从而实现对OTA的比色检测。第二部分:基于非标记适配体和金纳米酶构建OTA可视化试剂盒的研发。本章节在上一章的理论基础上,构建了基于非标记适配体和金纳米酶可视化检测OTA的比色传感器并研制了试剂盒。进行了体系优化、性能评估和食品基质中的实际样品检测。传感器的最佳试验参数如下:AuNPs浓度约6nM、适配体浓度500nM、缓冲液为醋酸-醋酸钠(10mM,pH3.8)、传感体系构建时间10min、底物TMB和H2O2浓度分别为2mM和1M,底物反应温度37℃、底物反应时间15min。缓冲液中检测范围在10~600nM之间,具有较好的线性关系,检测限为6.20nM。加入其它常见的共存真菌毒素时未发现明显的干扰作用,特异性良好。应用于燕麦、玉米、黄豆、大米、糯米等食品样本中OTA的检测,检测灵敏度在7.43nM~10.57nM之间,回收率在91.42%~109.35%之间,变异系数在1.13%~8.98%之间。此外,保存120天试剂盒质量稳定,可以保持标准曲线和灵敏度基本不变。
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