血液肿瘤是血液系统一系列恶性疾病的总称,包括急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和恶性组织细胞病等。在我国,血液肿瘤发病率较高。虽然联合化疗方案不断改进,支持治疗不断改善,血液肿瘤的初治CR不断提高,生存率也有明显提高。即使初始治疗达到完全缓解,但血液肿瘤复发率依然很高,尤其急性白血病长期生存率低。同时还有部分病例达不到CR,其长期生存率更低。复发、难治的病例至今仍治疗效果有限,缺乏理想的治疗手段。传统的肿瘤治疗方法有手术切除、放疗、化疗和靶向治疗,其中手术切除、放疗、化疗均是作用于肿瘤组织,只能局部清除肿瘤细胞,靶向治疗虽然能清除散在的肿瘤细胞,但存在肿瘤抗原变异和丢失、耐药等问题,均无法清除全身的肿瘤细胞,肿瘤的复发也就无法避免。肿瘤的免疫治疗作用于人体的免疫系统,通过提高人体免疫系统的清除肿瘤能力来达到治疗肿瘤的目的。在2013年,《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评为年度十大科技突破之首,为血液肿瘤的治疗带来曙光。过继性免疫细胞治疗,是将采自患者的或健康供者的PBMC,体外扩增活化后,将获得的免疫细胞回输给患者,利用活化的免疫细胞抗肿瘤活性来清除患者体内的肿瘤细胞。目前,过继性免疫细胞治疗应用的比较多的人体的免疫细胞有T淋巴细胞、NK细胞和DC细胞。T淋巴细胞被认为是机体唯一能特异性识别杀伤肿瘤细胞的免疫细胞。根据表达不同的TCR,T淋巴细胞可分为αβT和γδT细胞。γδT细胞是表达TCRγδ的T细胞亚群,γδT细胞只占外周T淋巴细胞1%-5%,但在组织中却可高达20-50%。γδT细胞属于人体的固有免疫细胞,在体内起着抗肿瘤、抗病毒感染、抗细菌感染和免疫监视等作用,能促进未成熟B细胞分泌Ig A,Ig M,Ig G,调节体液免疫,能活化未成熟DC细胞。γδT细胞,能以MHC非限制性的方式识别多种肿瘤相关抗原,可通过以下方式杀伤肿瘤细胞:通过凋亡诱导蛋白配体途径Fas-Fas L和TRAILR诱导肿瘤细胞凋亡;分泌大量的细胞因子,作用于肿瘤细胞及其微环境,直接或协同其他免疫细胞杀伤肿瘤细胞;通过ADCC和穿孔素-颗粒酶B杀伤肿瘤细胞;通过某些膜表面受体如FcγR,经ADCC发挥细胞毒作用;作为APC,发挥提呈抗原作用。已有不少临床试验应用γδT细胞于肿瘤的治疗,已在结直肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤治疗上取得进展,取得良好疗效和安全性。将γδT细胞应用于血液肿瘤的治疗有三个优势:活化的γδT细胞对肿瘤细胞强大的杀伤活性;γδT细胞能够分泌大量细胞因子和提呈抗原协同其他免疫细胞杀伤肿瘤细胞;血液肿瘤患者常存在免疫低下或缺陷,因此常引发感染,特别是机会感染,γδT细胞属于固有免疫细胞,应用于肿瘤的治疗时能在清除肿瘤细胞的同时,抗病毒和细菌感染。目的:本研究的目的就是建立γδT细胞培养体系,探讨γδT细胞对多种血液肿瘤细胞的杀伤活性,并初步探讨影响γδT细胞杀伤的一些机制,为γδT细胞应用于血液肿瘤的治疗提供实验依据。内容:本文的研究内容主要分二个部分。首先是优化Zol联合IL-2的培养方案,建立γδT细胞培养体系,比较两种无血清T细胞培养基Op Tmizer和X-VIVO15培养基体外培养γδT细胞的效果和添加血清对无血清Op Tmizer和X-VIVO 15培养基体外培养γδT细胞的影响;然后是采用流式细胞术检测γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226细胞的杀伤活性,检测γδT细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平,检测γδT细胞表达CD107a的水平,检测延长与靶细胞共孵育时间对γδT细胞对靶细胞的杀伤活性的影响,检测Zol和美伐他汀预处理对γδT细胞杀伤肿瘤细胞的影响,并比较γδT与NK和CIK细胞对K562细胞的杀伤作用。方法:1、优化Zol联合IL-2的培养方案,采用RPMI-1640培养基,建立γδT细胞培养体系,在此基础上,比较两种无血清T细胞培养基Op Tmizer和X-VIVO15培养基体外培养γδT细胞的效果,并比较添加血清对无血清培养基扩增γδT细胞的影响。2、体外培养Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226细胞,倒置显微镜下观察处于对数生长期,分别与γδT细胞共孵育,效靶比为10:1和20:1,共孵育4 h,用流式抗体标记后上流式细胞仪检测,比较γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、Raji、U-937和RPMI-8226细胞的杀伤活性和不同的效靶比对γδT细胞杀伤的影响。将γδT细胞与K562细胞按10:1的效靶比共孵育48 h,分别于0、4、16、24、36和48 h用流式细胞仪检测γδT细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平。将HL-60和K562细胞分别与γδT细胞按10:1的效靶比共孵育4 h和20 h后,用流式细胞仪检测延长共孵育时间对γδT细胞杀伤K562细胞的影响。用不同浓度的Zol预处理K562细胞,分别与γδT细胞按10:1的效靶比共孵育4 h后,用流式细胞仪检测不同浓度的Zol对γδT细胞杀伤K562细胞的影响。用5μmol/L的美伐他汀预处理K562细胞,后与γδT细胞按10:1的效靶比共孵育4 h后,用流式细胞仪检测美伐他汀对γδT细胞杀伤K562细胞的影响。签署知情同意书后,抽取4位淋巴瘤患者的外周血,分离得到PBMC,采用不同的培养体系体外扩增γδT与NK和CIK细胞,后分别与K562细胞按5:1、10:1和20:1的效靶比共孵育4 h后,用流式细胞仪检测,比较γδT与NK和CIK细胞对K562细胞的杀伤作用。结果:1、采用Zol联合IL-2的培养方案可以在体外扩增外周血γδT细胞;Op Tmizer培养基比X-VIVO 15培养基体外培养γδT细胞的效果好(P<0.05),适当加入血清能提高扩增效率(P<0.05)。2、发现γδT细胞对Jurkat、THP-1、HL-60、K562、U-937和RPMI-8226细胞均有明显的杀伤活性(P<0.05),对Raji细胞的杀伤作用较弱;随着与K562细胞共孵育时间的延长,γδT细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平基本呈现出时间依赖性增加,TNF-α自8h后逐渐增加;与K562细胞和HL-60细胞共孵育后,γδT细胞CD107a的表达水平均出现显著上调(P<0.01)。延长γδT细胞与K562和HL-60细胞共孵育时间,γδT细胞对K562和HL-60细胞的杀伤活性也明显增强(P<0.01)。Zol能提高γδT细胞对K562细胞的杀伤活性,而美伐他汀减弱了γδT细胞对K562细胞的杀伤活性;4位B细胞淋巴瘤患者均成功在体外扩增出γδT、NK和CIK细胞。效靶比为5:1时,γδT、NK和CIK细胞对K562细胞的杀伤活性无统计学差异(P>0.05),效靶比为10:1和20:1时,γδT细胞对K562细胞的杀伤活性与NK细胞无统计学差异(P>0.05),但明显强于较CIK细胞(P<0.01)。结论:Zol联合IL-2的培养体系体外成功扩增健康人外周血γδT细胞;Op Tmizer培养基比X-VIVO 15培养基体外培养γδT细胞的效果好,适当加入胎牛血清(FBS)能提高扩增效率;γδT细胞可显著杀伤多种血液肿瘤细胞;γδT细胞对K562细胞的杀伤活性与NK细胞无统计学差异,明显强于CIK细胞,;在48 h内随着与k562细胞共孵育时间的延长,γδT细胞分泌IFN-γ的水平呈时间依赖性增加,而TNF-α自8 h后逐渐增加;与K562和HL-60细胞共孵育后,γδT细胞的CD107a分子的表达有水平明显上调增加;延长γδT细胞与K562和HL-60细胞共孵育时间,γδT细胞对K562和HL-60细胞的杀伤活性也明显增强(P<0.01)。Zol能提高γδT细胞对K562细胞的杀伤活性,而美伐他汀减弱了γδT细胞对K562细胞的杀伤活性。总之,Zol联合IL-2体外培养的γδT细胞对多种血液肿瘤细胞均具有较高的杀伤活性。与靶细胞共孵育后,γδT细胞杀伤靶细胞的效率提高。提高效靶比和和延长与靶细胞共孵育时间,都能提高γδT细胞对靶细胞的杀伤活性。Zol能提高γδT细胞对K562细胞的杀伤活性,而美伐他汀减弱了γδT细胞对K562细胞的杀伤活性。为血液肿瘤的细胞免疫治疗提供实验依据。