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低聚果糖是一类重要的低聚糖。低聚果糖的生产可通过果糖基转移酶催化蔗糖获得。国内外对果糖基转移酶的研究主要集中在酶的筛选、纯化、酶学性质测定等方面。野生型果糖基转移酶存在热稳定性低、催化效率低等缺点,需通过分子改造方式提高酶的酶学性质。本文通过筛选获得一株具有高低聚果糖转化率的果糖基转移酶生产菌株,黑曲霉(Aspergillus niger)YZ59(CICIM F0901)。采用毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统分别实现了果糖基转移酶的异源表达,并分别对其酶学性质进行了分析与讨论。基于酶3-D结构解析,通过定点突变提高了该酶的热稳定性等。此研究对果糖基转移酶的高效异源表达、分子改造及基于重组酶进行低聚果糖的工业化生产具有重要指导意义。研究的主要结果如下:1.筛选获得一株具有低聚果糖高转化率的果糖基转移酶生产菌株,YZ59。通过菌株形态特征分析与18S r RNA测序比对等综合分析,鉴定此菌株属于黑曲霉(A.niger)。2.基于RT-PCR方式获得A.niger YZ59果糖基转移酶基因成熟酶区域(不含内含子)的c DNA序列,实现了在P.pastoris GS115中的异源表达。在5-L发酵罐中诱导96 h,果糖基转移酶最高产量达1020 U/m L。果糖基转移酶的最适温度和最适p H值分别为55℃和5.5。果糖基转移酶的稳定温度范围为低于50℃,稳定p H范围为3.0~10.0。果糖基转移酶比酶活力为6.8×104 U/mg。果糖基转移酶的Km、Vmax、kcat、kcat/Km值分别为159.8 g/L、0.7 g/(L·min)、1.1×104 min-1、68.8 L/(g·min)。5 m M Ni2+、Mg2+、K+、Fe3+或Mn2+对果糖基转移酶具有激活作用,但其他金属离子对酶具有抑制作用。采用果糖基转移酶催化蔗糖生产低聚果糖,其最高含量可达57.3%(w/w)。3.将果糖基转移酶基因fwt在S.cerevisae中实现了异源表达。发酵48 h后,果糖基转移酶最高酶活力可达19.8 U/m L。果糖基转移酶的最适温度为55℃,在低于50℃条件下稳定。果糖基转移酶的最适p H为5.5,稳定p H范围为4.0~9.0。果糖基转移酶的Km值和Vmax值分别为170.0 g/L和0.7 g/(L·min)。Ni2+和Mg2+可显著激活果糖基转移酶。4.采用Po PMu Si C Web Server软件分析果糖基转移酶3-D结构模型中热不稳定氨基酸残基,确定6种相应可显著提高热稳定的突变方式,分别为Asp64Leu、Gly80Trp、Gly123Leu、Glu377Gly、Arg397Ile、Glu575Tyr。突变体Glu377Gly和Arg397Ile的最适反应温度较突变前的最适反应温度均提高了5℃。Glu377Gly在60℃条件下的半衰期(t1/2)可达26.9 min。突变体Glu377Gly的阳离子-π作用力和β-转角均增加,且疏水性增强。突变体Glu377Gly对底物蔗糖的亲和力增强,同时其催化效率常数kcat值和kcat/Km值分别增加为突变前的1.6倍和2.1倍。突变后,葡萄糖对突变体Glu377Gly抑制作用降低。与突变前相比较,突变体Glu377Gly催化蔗糖生成低聚果糖的含量提高了2.7%。