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氧是需氧生物所必需的物质。动物为适应不同的低氧环境进化出了多样的氧感知与应答机制。高原低氧(Highaltitudehypoxia)和地下低氧(Subterranean hypoxia)是陆地具有代表性的两种低氧类型。为比较两种低氧环境对动物适应与进化的影响,本论文选择田鼠亚科(Arvicolinae)的3个物种,棕色田鼠(Lasiopodomysmandarinus)、布氏田鼠(L.brandtii)和青海田鼠(Neodonfuscus)进行比较研究:棕色田鼠属于地下鼠,布氏田鼠为低海拔地面鼠,青海田鼠则是高海拔地面鼠。利用比较转录组学方法分析Unigene的基因结构,揭示棕色田鼠和青海田鼠的适应性进化机制;采用有参转录组基因差异表达分析方法,在常压低氧舱内模拟急性低氧和慢性低氧处理条件,研究棕色田鼠和布氏田鼠脑组织低氧适应机制;采用有参转录组趋势表达分析方法,在低压低氧舱内模拟4个海拔低氧处理条件,研究青海田鼠和布氏田鼠脑组织低氧适应机制。本论文从转录组进化和基因差异表达两个层面系统揭示地下鼠及高原鼠的低氧适应与进化机制,为陆栖哺乳动物低氧适应与进化理论提供新证据,并为其低氧调控的分子机制提供新的见解。主要研究结果分述如下:1.脑转录组测序、Unigene的组装和注释三种田鼠的15个脑组织样品共获得210 Gbp高质量转录组数据,3种田鼠Unigene N50长度均大于2300bp,BUSCO评估转录本组装效果较好;青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠的Unigenes分别得到27572、27663和28314个注释结果。2.三种田鼠脑转录组进化分析以青海田鼠、棕色田鼠和布氏田鼠为研究对象,人和小鼠为外缘物种,利用软件Ortho MCL对蛋白序列进行同源基因的序列比对及过滤,共筛选到7039个单拷贝直系同源基因。5个物种进化速率(dN/dS)差异极显著(秩和检验,P<0.0001),且物种间两两比较差异均达到极显著水平(秩和检验,P<0.0001),青海田鼠进化速率最快(0.3022),棕色田鼠次之(0.2862),布氏田鼠第三(0.2713),小鼠(0.1933)和人(0.1702)依次为第四、第五。共鉴定到棕色田鼠正选择基因196个,主要富集在过氧化物酶体(ko04146)、DNA损伤修复过程(GO:0006281)等;鉴定到青海田鼠正选择基因284个,不仅包含过氧化物酶体、DNA损伤修复过程等与棕色田鼠相同的条目,还有嘌呤代谢(ko00230)、细胞凋亡过程(GO:0006915)以及氧化还原过程(GO:0055114)等条目。3.棕色田鼠和布氏田鼠急性低氧脑转录组差异表达分析1)有参转录组分析结果表明,5%急性低氧处理条件下,①共得到棕色田鼠差异表达基因(DEGs)460个,其中上调DEGs的功能主要与发育(GO:0032502)和对压力的反应(GO:0006950)等有关,下调的则主要是基因表达调节和代谢过程(GO:0051252、GO:0010468、GO:0019222);KEGG 显著富集通路(ko04510、ko04151、ko04015、ko04310)主要与抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和血管生成有关;②共得到布氏田鼠DEGs 1120个,其中上调DEGs的功能多与免疫过程(GO:0002376、GO:0006955)、对刺激的反应(GO:0009605、GO:0050896)、运动(GO:0040011)等有关,下调DEGs的功能则主要与细胞表面受体信号通路的调节(GO:0007166)有关。2)GSEA富集分析结果表明,①棕色田鼠主要上调了细胞增殖,血管生成以及细胞对外界刺激的反应等功能,下调了氧化磷酸化,蛋白质的分泌以及细胞周期等耗氧的过程;②布氏田鼠上调的基因集与棕色田鼠上调基因集的效应较一致,不同的是布氏田鼠下调了 DNA修复通路相关的基因。4.棕色田鼠和布氏田鼠慢性低氧脑转录组差异表达分析1)有参转录组分析结果表明,10%慢性低氧处理条件下,①共得到棕色田鼠DEGs 439个,主要参与激活HIF、黏着斑、P13K-Akt和Rap1信号通路;②共得到布氏田鼠DEGs 215个,上调的主要是神经递质兴奋的调节能力(GO:0005509)等功能以及与免疫(ko04610、ko04512、ko04060)相关的通路,下调的基因主要参与对低氧刺激的反应(GO:0051716)以及体内各种类型膜的信号转导(GO:0023052、GO:0007165)。2)GSEA富集分析结果显示,①棕色田鼠上调的基因集与KEGG富集结果较为一致,都有黏着斑信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路,下调的基因集有许多神经性疾病类的基因集,如帕金森症,亨廷顿氏病,阿兹海默症,以及RNA降解过程。②布氏田鼠上调的基因集主要参与调节糖酵解,促进血管生成等功能,下调的基因集除与棕色田鼠下调的神经性疾病通路较一致之外,还涉及癌症通路。5.青海田鼠和布氏田鼠高海拔低氧脑转录组分析设置100 m,3000 m,5000 m和7000 m等4个模拟海拔处理组,以|log2(fold change)丨>2,P-adj<0.05为条件筛选DEGs,2种田鼠DEGs数均随海拔升高而增加;经趋势分析,在青海田鼠所有显著性趋势块中,选择显著性最大的两个,即线性上调组和线性下调组,与布氏田鼠进行比较分析。两种田鼠的线性上调组都涉及血管生成(GO:0001525)功能,青海田鼠还富集到细胞周期(GO:0007049)、蛋白质的转运(GO:0015031、GO:0006810)以及细胞对 DNA损伤刺激的反应(GO:0006974)等,布氏田鼠富集到对缺氧(GO:0001666)和寒冷的反应(GO:0009409)、糖酵解过程(GO:0061621)以及代谢相关的通路(ko00010、ko01200);线性下调组中,青海田鼠在免疫反应等方面有功能富集,而布氏田鼠未在低氧方面显著富集到相关的通路或功能。主要结论如下:1)青海田鼠,棕色田鼠和布氏田鼠的进化速率(dN/dS)较快,是比较转录组学进化分析较好的生物模型。棕色田鼠和青海田鼠均对各自低氧环境产生了适应性进化,棕色田鼠正选择基因在氧化应激、代谢以及DNA损伤修复等方面显著富集,青海田鼠正选择基因不仅与棕色田鼠有相似的功能富集,而且还在嘌呤代谢、细胞凋亡以及氧化还原等功能显著富集。这可能是因为地下低氧环境相对简单,洞道内温度、湿度相对稳定,而与高原低氧相关的低温、强紫外线等环境因子更为复杂、严酷。结果表明,地下鼠和高原鼠都在氧化应激、代谢以及DNA损伤修复等方面对低氧环境产生了适应性进化。2)棕色田鼠对环境低氧表现出更强的氧感知与调控能力,布氏田鼠则表现为低氧胁迫应答。急性低氧使得棕色田鼠应对压力的反应等功能相关的基因显著上调,代谢过程相关的基因显著下调;而布氏田鼠受损更重,上调了免疫反应和对刺激的反应,下调DNA修复的过程。慢性低氧处理激活了棕色田鼠HIF信号通路,下调神经类疾病相关通路;布氏田鼠上调神经递质的调节能力、免疫、信号转导以及对低氧的反应。结果表明,棕色田鼠对低氧环境的感知和调节能力较强,布氏田鼠则表现为低氧胁迫应答,且随环境低氧强度则加深而胁迫效应加重。3)青海田鼠对高原低氧有更好的适应性,下调的免疫等耗氧过程相关的基因,且上调了提高细胞周期和DNA损伤修复的反应等基因,可以快速更新细胞,维持机体的正常功能;布氏田鼠上调的基因主要参与对缺氧和寒冷的反应、糖酵解过程以及代谢相关的通路和功能。总之,我们的研究表明,持续而稳定的环境低氧压力导致青海田鼠和棕色田鼠产生相近的分子进化机制,而环境O2含量的变化则可导致物种产生多样性的生理应答机制。