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干旱胁迫作为最主要的非生物胁迫,严重影响着植物的生长和发育。因此,植物进化出一系列的调控机制来响应干旱胁迫。干旱胁迫响应蛋白主要分为两类,一类是调节蛋白,如转录因子和激酶等。另一类是功能蛋白,主要包括渗透调节蛋白以及胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)等。脱水素蛋白属于LEA蛋白家族,其表达水平受到渗透胁迫的显著诱导。目前关于脱水素蛋白的研究,主要集中于其体外作为保护因子对蛋白质的保护作用,而其在体内的功能仍有待进一步深入研究。截型苜蓿MtCAS31编码一个31 kDa的脱水素蛋白。本实验室早期研究发现MtCAS31能够显著提高转基因拟南芥的抗旱性。本论文进一步深入研究了MtCAS31作为截型苜蓿内源蛋白在截型苜蓿体内的功能。对MtCAS31的组织表达分析表明,MtCAS31在截型苜蓿的根、茎、叶、气孔、维管组织以及根瘤中表达。RT-qPCR结果表明MtCAS31受到脱水胁迫、高盐、低温以及ABA的显著诱导。为了研究MtCAS31在截型苜蓿体内的功能,通过农杆菌介导的遗传转化,获得了MtCAS31的过表达材料MtCAS310E和敲除突变体cas31。生理指标证据表明,在干旱胁迫下MtCAS31显著降低截型苜蓿的蒸腾速率和气孔导度,进而提高截型苜蓿的抗旱性。为了解析MtCAS31提高截型苜蓿抗旱性的分子机制,以MtCAS31为诱饵蛋白,对本实验室构建的截型苜蓿非生物胁迫cDNA文库进行筛选,筛选到一个PIP2家族的水通道蛋白MtPIP2;7,并进一步利用酵母双杂交实验、GST pull-down实验以及双分子荧光互补实验证实其互作。本研究通过对根的水导测量和抗旱性分析表明,pip2;7突变体根的导水能力显著低于野生型,而抗旱性显著高于野生型,表明MtPIP2;7作为水分转运蛋白,在干旱胁迫响应中发挥负调控因子的作用。进一步利用30%PEG 8000进行脱水处理模拟干旱胁迫,分析MtPIP2;7的蛋白水平。结果表明在脱水条件下,MtPIP2;7蛋白能够被降解;而在施加26S蛋白酶体抑制剂MG132或自噬降解抑制剂ConcA后,MtPIP2;7的蛋白降解均被抑制,表明脱水胁迫下MtPIP2;7既能通过泛素/26S蛋白酶体途径降解也能通过自噬途径降解。为了探究MtCAS31对MtPIP2;7降解是否有影响,本研究将野生型和cas31突变体进行脱水胁迫处理,通过施加蛋白降解抑制剂,证明MtCAS31能够促进MtPIP2;7的自噬降解。为了解析MtCAS31影响MtPIP2;7的自噬降解的分子机制,通过酵母双杂交实验,双分子荧光互补实验以及蛋白质免疫共沉淀实验,发现MtCAS31能够与自噬起始相关蛋白MtATGI互作,并且形成MtPIP2;7-MtCAS31-MtATG1复合体,影响MtPIP2;7自噬降解的起始。根的水导测量结果表明,干旱条件下cas31突变体根的水导显著高于野生型。由于水通道蛋白对水分的转运是高水势向低水势转运的被动运输过程,而干旱条件下,植物根系中水势高于土壤,因此干旱条件下水分从植物根系中向土壤转运,导致水分流失。由此可知,干旱条件下,根的水导越大则水分流失程度越高。以上结果表明,在干旱胁迫条件下,大量表达的MtCAS31促进MtPIP2;7通过自噬途径降解,降低根的水分转运能力,从而减少干旱条件下的水分流失,提高截型苜蓿的抗旱性。MtCAS31不仅在根、茎和叶片中表达,在根瘤中也大量表达。本研究对MtCAS31在根瘤的功能进行深入研究。通过固氮酶活性检测实验,证明了在干旱条件下cas31中固氮酶活性显著低于野生型,表明MtCAS31能够在干旱条件下影响固氮效率。酵母双杂交实验,GST pull-down实验以及双分子荧光互补实验表明,MtCAS31能够与共生固氮过程中重要蛋白豆血红蛋白MtLb120-1互作。通过RNAi将MtLb120-1干扰后,MtLb120-1 RNAi干扰材料的固氮酶活性显著低于对照材料,表明MtLb120-1能够影响共生固氮效率。为了解析MtCAS31与MtLb120-1的互作对于固氮效率的影响,通过蛋白体外保护实验,证明了 MtCAS31对MtLb120-1有保护作用。以上结果表明MtCAS31能够在干旱胁迫条件下保护MtLb120-1,从而影响固氮效率。文献报道豆血红蛋白的缺失不仅会影响固氮效率,也能影响共生体的发育。本研究利用透射电镜和Lugol染色,证明在干旱条件下cas31的根瘤中有更多淀粉粒积累,根瘤中淀粉的积累反映了根瘤的衰老。进一步通过RT-qPCR证明了cas31根瘤中胁迫诱导的衰老相关基因的表达水平显著高于野生型,表明干旱胁迫下MtCAS31延缓干旱诱导的根瘤衰老。综上所述,本论文研究发现了脱水素蛋白在干旱胁迫中新功能。脱水素蛋白MtCAS31既能促进水通道蛋白的自噬降解进而减少干旱条件下水分流失,同时也能在根瘤中通过保护豆血红蛋白而降低干旱胁迫对于共生固氮过程的不利影响。本论文的研究结果使我们深入理解脱水素蛋白在干旱胁迫中的重要作用,完善了脱水素蛋白响应干旱胁迫的分子机制。