论文部分内容阅读
白内障是世界范围主要的致盲眼病,据预测到2020年每年会有2000-2500万患者需行白内障手术。这无疑会对社会和国家造成巨大的经济负担。因此,探求白内障的发病因素及发病机理,延缓和阻止白内障发生及发展显得尤为重要。国内外医学工作者尤其是眼科工作者为此做出了巨大的努力,并取得了令人瞩目的成绩。近年来越来越多的证据表明晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells,LECs)凋亡可能是各种非先天性白内障形成的细胞学基础。因此,检测年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞凋亡发生的分子机制,抑制晶状体上皮细胞的凋亡过程,为延缓和阻止年龄相关性白内障的发生和发展提供了新的思路。线粒体蛋白Smac/DIABLO(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI),被称为第二线粒体来源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂,是一种存在于线粒体并且调节细胞凋亡的蛋白质。既往研究显示在年龄相关性白内障中Smac可能参与了晶状体上皮细胞的凋亡过程以及白内障的形成。因此,如果能特异性沉默Smac基因,观察其下调前后晶状体上皮细胞内凋亡的变化,对白内障发病机制的研究具有重要意义。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在生物体内,内源性或外源性的双链RNA(double. stranded RNA, dsRNA)引起与其同源的mRNA特异性降解,导致转录后阶段的基因沉默。dsRNA经酶切后会形成很多小片段siRNA (Small interfering RNA,siRNA),这些小片段siRNA是一种小RNA分子,一旦与信使RNA(mRNA)中的互补序列互相结合,会导致整条mRNA失去翻译成蛋白质的功能,RNA干扰技术是一种强大的实验工具,能够高效、特异的使靶基因沉默。本实验拟使用RNA干扰技术实现对Smac基因的特异性沉默,为进一步探索凋亡与白内障形成之间的关系奠定基础。研究目的构建针对Smac基因带有筛选标记的siRNA慢病毒载体并测定目的基因在晶状体上皮细胞中的表达情况,为利用RNA干扰(RNAi)技术探讨白内障发病机制与细胞凋亡的关系奠定基础。方法1.永生化人晶状体上皮细胞(HLE-B3)的培养：将冻存的晶状体上皮细胞复苏后,放入含有20%胎牛血清的DMEM培养基中,置于含5%CO2、37℃的细胞培养箱内培养,取融合至90%的细胞用于实验。2.构建针对Smac的慢病毒载体,用于病毒的生产。3.设立空白对照组、阴性对照组和siRNA组,进行相应病毒感染,病毒感染细胞16h后换液,并在72h后荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)在晶状体上皮细胞的表达。4.慢病毒感染细胞96h后提取细胞中的总RNA,做三次重复的实时定量多聚酶链式反应(Real-time PCR)。实验中我们采用家族管理基因GAPDH作为内参基因。结果(1)绿色荧光蛋白(GFP)在人晶状体上皮细胞中成功表达,在荧光显微镜下观察,荧光表达明亮均匀,无明显细胞毒性,对感染72小时后的细胞照相,发现每一组的感染率都在80%左右。(2) RT-PCR检测Smac基因mRNA水平在晶状体上皮细胞的表达情况发现siRNA组mRNA的量与阴性对照组比较显著下调,敲减效率达66.5%。(P<0.05)。结论成功构建了慢病毒载体结构来表达siRNA以达到对Smac基因的沉默,为进一步研究白内障发病机理与细胞凋亡的关系奠定基础。