目的研究和评价外周血T细胞亚群、骨髓T淋巴细胞内IFN-γ表达和Th₁／Th₂及Tc₁／Tc₂比值以及HLA-DRB1*1501表型等指标的不同组合在再生障碍性贫血（AA）患者免疫抑制疗法（IST）疗效预测中的敏感度和特异度，初步确定其临床应用价值；研究和分析骨髓T淋巴细胞内IFN-γ染色与HLA-DRB1*1501表型联合检测在IST疗效预测中的临床应用价值；研究和探讨建立一个以临床、免疫学功能指标和遗传学指标为基础的多变量再障IST疗效预测模型的可行性。方法51例接受含环孢菌素A的IST方案治疗的原发性AA患者入选，其中男性30例，女性21例；中位年龄32岁（12岁～79岁）；重型（SAA）42例（82.4％），包括8例（15.7％）极重型（VSAA）患者，非重型（NSAA）9例（17.6％）；初治患者39例（76.5％），既往治疗过的患者12例（23.5％）；对IST反应良好的患者35例（68.6％），无效16例（31.4％）；单用CsA治疗的35例（68.6％），CsA+ATG／ALG治疗的16例（31.4％），无单用ATG／ALG治疗的患者。患者治疗前流式细胞术（FCM）检测外周血CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞亚群、骨髓CD4⁺和CD8⁺细胞内IFN-γ、IL-4以及Th₁／Th₂、Tc₁／Tc₂，经随访观察判定疗效，比较不同疗效反应的患者上述各项指标的差异，比较不同疗效患者治疗前后上述指标的变化，评价和比较上述免疫指标在AA患者IST疗效预测中的应用价值。患者治疗前外周血提取DNA，以PCR-SSP法检测HLA-DRB1*1501表型，分析骨髓T细胞内IFN-γ染色与HLA-DRB1*1501联合试验与AA患者IST疗效的关系，评价联合试验在AA患者IST疗效预测中的潜在应用价值。通过上述分析研究，选择对患者疗效反应预测价值相对较高的免疫学和遗传学指标，结合反映患者病情严重程度的临床指标建立一个多变量模型，分析和探讨多项观察指标的组合在AA患者IST疗效预测中的潜在应用价值。结果①分析不同疗效的患者治疗前外周血T细胞亚群发现，有效的患者治疗前CD4⁺细胞数量明显高于无效的患者（P=0.003）；32例患者治疗后复查发现，有效的患者治疗后CD8⁺细胞数量显著降低、CD4⁺／CD8⁶比值显著升高（P=0.001和0.002），而无效的患者治疗前后上述各项指标无显著差异；CD4⁺／CD8⁺倒置与无倒置的患者有效率分别为54.5％和79.3％，无显著差异。②骨髓CD4⁺细胞内IFN-γ阳性和CD8⁺细胞内IFN-γ阳性的符合率为100％，细胞内IFN-γ阳性的患者有效率明显高于细胞内IFN-γ阴性的患者，分别为84.6％（33／39）和16.7％（2／12），P=0.001；因此，细胞内IFN-γ阳性能预示IST有效，在全部AA患者中，灵敏度为94.3％（33／35），特异度为62.5％（10／16），准确率为84.3％（33+10／51），阳性预测值为84.6％（33／39），阴性预测值为83.3％（10／12）；而在初治患者中，细胞内IFN-γ阳性的灵敏度为100％（27／27），特异度为58.3％（7／12），准确率为87.2％（27+7／39），阳性预测值为84.4％（27／32），阴性预测值为100％（7／7）。③不同疗效的AA患者在CD4⁺IFN-γ⁺、CD8⁺IFN-γ⁺、CD4⁺IL-4⁺、CD8⁺IL-4⁺、Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂水平上无显著差异，但在IFN-γ阳性的患者中，无效的患者Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂明显高于有效的患者（P=0.043和0.041），分别以Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂＜50为界点，两组患者疗效有明显差异（P=0.040和0.002），但在总的AA患者中无明显差异，提示以细胞内IFN-γ定性实验结合Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂分层是可行的。在细胞内IFN-γ染色阳性的患者中，CD4⁺IFN-γ⁺且Th₁／Th₂＜50判断治疗有效的灵敏度为54.5％（18／33），特异度为66.7％（4／6），准确率为56.4％（18+4／39），阳性预测值为90.0％（18／20），阴性预测值为21.1％（4／19）；CD8⁺IFN-γ⁺且Tc₁／Tc₂＜50判断治疗有效的灵敏度为72.7％（24／33），特异度为66.7％（4／6），准确率为71.8％（24+4／39），阳性预测值为92.3％（24／26），阴性预测值为28.6％（4／14）。提示CD4⁺或CD8⁺细胞内IFN-γ阳性联合Th₁／Th₂或Tc₁／Tc₂＜50对IST治疗有效可能具有较高的阳性预测价值，且CD8⁺IFN-γ⁺与Tc₁／Tc₂＜50联合的检验效能优于CD4⁺IFN-γ⁺与Th₁／Th₂＜50联合。检测28例AA患者治疗前后细胞内IFN-γ、IL-4和Th₁／Th₂、Tc₁／Tc₂的变化发现，有效的患者治疗后CD4⁺和CD8⁺细胞内IFN-γ明显降低（P=0.001），细胞内IL-4明显升高（P=0.001和0.018），Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂水平明显降低（P=0.001），而无效的患者上述指标无显著变化。④分别对外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺细胞数量、CD4⁺／CD8⁺比值以及骨髓CD4⁺IFN-γ⁺、CD8⁺IFN-γ⁺、CD4⁺IL-4⁺、CD8⁺IL-4⁺、Th₁／Th₂和Tc₁／Tc₂定量数值在AA患者IST疗效预测中的诊断价值进行ROC曲线分析显示，CD8⁺细胞内IFN-γ的诊断价值最高，且有显著性意义（P=0.009），其曲线下面积（AUC）为0.730，CD8⁺细胞内IFN-γ界点在7.89时，该指标的灵敏度为0.914，误诊率（1-特异度）为0.500。⑤分析不同疗效反应的AA患者HLA-DRB1*1501表型发现，35例有效的患者HLA-DRB1*1501表现型频率和基因型频率分别为0.457和0.263，明显高于16例无效的患者（表现型和基因型频率分别为0.125和0.065，P＜0.05）。HLA-DRB1*1501阳性判断IST有效的灵敏度为45.7％（16／35），特异度为87.5％（14／16），准确率为58.8％（16+14／51），阳性预测值为88.9％（16／18），阴性预测值为42.4％（14／33）。细胞内IFN-γ染色与HLA-DRB1*1501联合两者全部阳性判断IST治疗有效的灵敏度为42.9％（15／35），特异度为93.7％（5+1+9／16），准确率为58.8％（15+5+1+9／51），阳性预测值为93.7％（15／16），阴性预测值为42.8％（5+1+9／23+2+10）。分别对单一CD8⁺细胞内IFN-γ和HLA-DRB1*1501检测以及联合后并行试验和串联试验进行ROC曲线分析，曲线下面积分别为0.862、0.872、0.883和0.910（P均=0.001），以CD8⁺细胞内IFN-γ与HLA-DRB1*1501联合串联试验的曲线下面积最大，表明CD8⁺细胞内IFN-γ与HLA-DRB1*1501串联试验的检验效能最佳。⑥由Logistic回归方程计算出的CD8⁺细胞内IFN-γ与HLA-DRB1*1501双阳性、细胞内IFN-γ阳性伴HLA-DRB1*1501阴性、细胞内IFN-γ阴性伴HLA-DRB1*1501阳性和CD8⁺细胞内IFN-γ与HLA-DRB1*1501双阴性四组患者的预测概率分别为0.890、0.774、0.345和0.182。⑦根据既往文献回顾和上述分析结果，选择中性粒细胞绝对计数（ANC）分层、骨髓T细胞内IFN-γ染色、Tc₁／Tc₂分层和HLA-DRB1*1501表型四种指标建立一个代表临床、免疫学和遗传学指标的多变量模型，由Logistic回归过程得到回归方程，并得到一个含有上述四种变量预测概率的中间变量，然后对这个中间变量进行ROC曲线分析，可得到含有多变量预测概率的诊断点，在实际工作中可应用诊断点和回归方程对个体患者治疗有效的概率进行预测。结论①本研究应用转译性研究方法，对目前临床上常用的和具有临床应用潜能的IST疗效预测指标进行了研究和评价，结果证实反映患者免疫功能受损的免疫学指标检测是原发性AA患者IST疗效预测的关键环节，不同的免疫指标检测在预测AA患者IST疗效中的意义各不相同。FCM检测骨髓T细胞内IFN-γ操作简便、实用性强，在所评价的免疫功能指标中，敏感性和特异性最好，特别是CD8⁺细胞内IFN-γ定性和定量实验对AA患者IST疗效的预测价值最高。对于初治患者来说，细胞内IFN-γ染色具有很强的阴性排除性诊断价值，但缺点是对于占原发性AA大多数的、细胞内IFN-γ阳性的患者来说，预测价值有限。仅凭Th₁／Th₂和Tc₁／Tc2数值的高低不能预测IST疗效，但如果结合细胞内IFN-γ染色的定性实验，则可对判断预后有重要意义，CD8⁺细胞内IFN-γ阳性且Tc₁／Tc₂＜50预示患者有更多的机会通过IST治疗而获得缓解，两者的结合有助于补充单独细胞内IFN-γ染色适用范围狭窄的缺点。虽然外周血CD4⁺和CD8⁺细胞数量和比值及其变化与患者对IST疗效反应以及不同疾病状态有一定联系，但CD4⁺／CD8⁺倒置作为疗效预测指标缺乏必要的敏感性和特异性，缺乏临床应用前景。②骨髓T细胞内IFN-γ和HLA-DRB1*1501表型联合检测可以作为预测AA患者IST疗效的、具有临床实用价值的一种指标，联合检测能弥补单—HLA-DRB1*1501表型检测灵敏度差的缺陷，并有助于提高骨髓T细胞内IFN-γ染色预测IST疗效的特异度。串联试验阳性预测IST治疗有效的准确性更强，这对于大多数细胞内IFN-γ阳性的原发性AA患者来说有重要意义。骨髓T细胞内IFN-γ和HLA-DRB1*1501双阳性和细胞内IFN-γ阳性伴HLA-DRB1*1501阴性的患者都预示对IST治疗有效，但前者有效的可能性高于后者。更重要的是，这两种实验技术条件成熟，方法简便，适合临床快速检验的要求，所得到的四种检测结果的组合能帮助临床医生快速地对患者治疗有效的概率做出初步判断，该联合检测方法为临床提供了一种有效且方便的IST疗效预测方法。③本研究首次提出并探讨了以临床、免疫学和遗传学指标为基础建立一个多变量再障IST疗效预测模型的可行性，这种多变量模型的建立有助于多层次地分析患者的个体差异，这种差异可能在一定程度上代表了异质性患者某种占居主导地位的发病机制和遗传学特质，可以弥补单变量指标在疗效预测的准确性上的不足，使之更加适应临床复杂性的要求，因而具有潜在的临床应用价值。