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目的:眼部新生血管疾病包括增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP),此类疾病在发达国家已经成为从婴幼儿到老年人各个年龄阶段致盲和视力障碍的最主要原因,在中国亦是严重致盲性眼病之一,严重影响了患者的生活质量。目前对于此类疾病的临床治疗包括都存在损伤组织、容易复发的特点,使此类疾病致盲的人群仍然不断扩大。因此研究基于控制新生血管发生发展的新型治疗模式十分必要。新生血管生成是一个多因素参与的复杂病理过程,以VEGF为代表的多种生长因子在其发生发展过程中起作用。HGF是一种内皮特异性生长因子,与视网膜血管内皮细胞的酪氨酸激酶受体c-met结合刺激其增殖及迁移。最新研究发现PDR患者的血清与玻璃体中HGF的浓度显著升高,同时体外实验发现HGF具有较强的促视网膜内皮细胞有丝分裂活性,提示HGF通路是视网膜新生血管生成的重要中间途径之一。而HGF的一些结构域分子具有抗血管生成活性,如HGF的α链包含4个Kringle结构域和氨基末端发夹结构域(NK4)具有抗VEGF诱导的新生血管生成作用,Kringle1-4,N末端结构域及Kringle1也同样具有抗新生血管生成作用。有文献报道HGF的kringle1结构域(HGFK1)可以通过EFGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),抑制肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的体外增殖及血管形成,并在大鼠肿瘤动物模型中抑制血管生成。眼部新生血管与肿瘤新生血管有相似的发病机制及参与因子,因此HGFK1可能同样具有治疗视网膜新生血管的作用。基因治疗是将正常基因、重组基因或RNA导入人体细胞,使其发挥生物学效应从而达到治疗疾病的目的。基因治疗眼部疾病具有诸多优势,在近年来取得显著进步,在众多视网膜疾病的基因治疗研究中证实AAV是安全有效的基因治疗载体,由AAV介导的基因治疗能够使具有抗新生血管作用的因子长期稳定制造和释放,并已经成为视网膜新生血管性疾病的有效治疗方法。因而,AAV重组的HGFK1(rAAV-HGFK1)可能成为一种新的视网膜新生血管性疾病基因治疗的方法。本研究的目的在于通过rAAV-HGFK1干预体外培养的牛视网膜血管内皮细胞,玻璃体腔注射干预氧诱导小鼠新生血管模型,以验证rAAV-HGFK1对视网膜新生血管生成的影响。方法一、rAAV-HGFK1对牛视网膜血管内皮细胞(BREC)的影响。1.体外分离和培养BREC,建立稳定传代的BREC。分离新鲜牛眼球的视网膜微血管,用胶原酶消化,过滤后接种于fibronectin包被的培养皿,定期观察和换液,待细胞团生长至一定程度,用差异消化和传代的方法,建立稳定传代的BREC。并用Von Willebrand因子抗体进行鉴定。2.观察rAAV-HGFK1对BREC增殖和凋亡的影响。用不同的条件处理BREC细胞,在不同时间点,用MTS的方法观测细胞的增殖情况,用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。3.分析HGFK1作用的分子机制。用不同的条件处理BREC细胞,在不同时间点收集细胞,提取细胞的总蛋白,用免疫印迹分析的方法检测可能的信号通路中蛋白质的表达情况。二、rAAV-HGFK1对低氧诱导的小鼠视网膜病变模型的影响。1.低氧诱导的小鼠视网膜病变(OIR)模型的建立和HGFK1表达的鉴定。1)C57BL/6J小鼠(出生第7天,P7)饲养于75±2%氧浓度的饲养箱至出生第12天(P12),小鼠与哺乳母鼠同时饲养于培养箱。P12,小鼠返回正常氧浓度饲养。2)于出生第19天(P19),用病理方法检测视网膜新生血管的增殖情况。用荧光眼底血管造影的方法观测小鼠新生血管的情况,评判造模是否成功。3)小鼠出生第3天(P3)行玻璃体腔注射:一侧眼注射0.5μl rAAV-EGFP,对侧眼作为对照注射0.5μl磷酸盐缓冲液。分别于出生第13天、第17天、第21天进行病理切片并检测绿色荧光蛋白的表达。2.rAAV-HGFK1对OIR小鼠新生血管的影响。将三窝共12只C57BL/6J小鼠,按前面所述方法建立OIR模型。出生第3天(P3)行玻璃体腔注射:一侧眼注射0.5μl rAAV-HGFK1,对侧眼注射0.5μl rAAV-EGFP。出生第19天(P19),每窝取3只小鼠处死并迅速摘除眼球,放入4%多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋切片。矢状方向每100μm切取5μm切片,切片用于HE染色以及免疫组化检测,显微镜下观察新生血管的情况并定量分析。另外于P19每窝取1只小鼠,腹腔注射水合氯醛深度麻醉,行心脏灌注荧光眼底血管造影检测。结果一、rAAV-HGFK1对BREC细胞的影响。1.能够成功分离和培养原代BREC细胞,建立稳定传代的BREC细胞。2.rAAV-HGFK1能有效感染BREC,在病理条件下抑制其细胞增殖,促进细胞凋亡。3.HGFK1的表达能够抑制ERK的活化,促进p38 MAPK的活化,可能通过MAPK途径对BREC进行调节。二、rAAV-HGFK1对OIR模型的影响。1.小鼠出生第19天(P19)荧光眼底血管造影表现为视网膜血管灌注明显减少,血管结构遭到破坏,伴有血管渗漏。眼球病理切片可见大量内皮细胞核突破内界膜或与内界膜相连,部分形成明显的血管腔,rAAV-EGFP玻璃体腔注射后可以在出生第17天(P17)视网膜检测到绿色荧光蛋白表达,并在出生第21天(P21)表达增强。OIR小鼠模型能够成功建立,可以进行下游实验。2.P19的荧光造影中rAAV-HGFK1治疗组小鼠视网膜缺血及微血管病变程度明显好转,新生血管增殖病变的定量分析发现rAAV-HGFK1治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核数明显少于对照组,免疫组织化学检测rAAV-HGFK1治疗组CD31及VEGF表达少于对照组。结论1.rAAV-HGFK1体外抑制VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞增殖,并促进其凋亡,可能通过包括ERK以及p38 MAPK的MAPK途径的信号分子调节视网膜血管内皮细胞。2.rAAV-HGFK1可以在OIR小鼠模型中抑制视网膜血管内皮细胞增殖,减少新生血管的生成,从而可能有效治疗视网膜新生血管性疾病。