论文部分内容阅读
MicroRNAs(miRNAs)在基因表达的转录调控中起着重要作用。miRNAs缺失可影响脂肪组织的形态、结构和大小,甚至导致其基本功能的损伤。支链氨基酸(BCAA)包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。在脂肪组织中,过多的BCAA摄入会转化成脂肪储存起来,脂肪组织有效地把BCAA碳骨架转化成新的脂肪酸,作为脂肪分化和脂肪合成的碳来源,所以BCAA的摄入有利于成脂功能。BCAT2是BCAA代谢过程中的第一个催化酶,催化BCAA分解为支链酮酸的可逆反应。脂肪分化过程中,BCAT2还参与支链氨基酸的代谢。在后续分解过程中,支链酮酸需在限速酶支链酮酸脱氢酶复合体(BCKDH)作用下才能特异性分解,BCKDHA和BCKDHB是BCKDH E1结构的α和β亚基,它们同样参与BCAA的代谢与脂肪的代谢。BCAT2,BCKDH 和BCKDHB三者的异常表达,都会引起BCAA代谢的紊乱、代谢产物的大量积累以及三羧酸循环过程的障碍,在一定程度上影响了机体能源物质的供应,甚至会造成一些代谢疾病。本研究采用绵羊前体脂肪细胞为试验对象,首先对采取的细胞进行验证,通过对培养和分化过程中的不同时段观察细胞形态、油红O染色以及有关脂肪细胞分化的标志基因的检测,增加所有结果的可信度。利用生物信息学软件,预测能与BCAT2、BCKDHB结合的miRNAs。构建BCAT2-3’-UTR和BCKDHB-3’-UTR的双荧光素酶报告载体PmirGLO-BCAT2-3’-UTR 及 PmirGLO-BCKDHB-3’-UTR,购买 miR-433-3p 及 miR-330-5p的过表达载体mimics,培养HEK-293T细胞进行共转染后收集细胞,使用双荧光素酶报告系统分别检测其荧光活性,进行BCAT2与miR-330-5p、BCKDHB与miR-433-3p靶标关系验证。分别过表达miR-330-5p和miR-433-3p探索对绵羊前体脂肪细胞分化的调控机制,各自都分为过表达组和阴性对照组,提取总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR分别检测过表达前后的miRNAs和靶基因的表达量,同时利用Western blotting技术分别检测过表达前后BCAT2和BCKDHB的蛋白水平。在过表达miR-330-5p前后,对脂肪分化的标志基因进行了 mRNA表达以及脂滴变化的检测。用RT-qPCR技术分别检测前体脂肪细胞分化过程中BCAT2和miR-330-5p,BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。同时,利用腺病毒载体pMSCV过表达BCAT2,利用BCAT2的siRNA敲除BCAT2,分别检测过表达和敲除前后BCAT2、BCKDHA和BCKDHB三种mRNA和蛋白的表达量,同时检测脂肪分化的标志基因的表达变化,以及检测转染前后脂滴变化,从而说明BCAT2对前体脂肪细胞分化过程的影响。本研究通过理论预测和试验验证,分别揭示了 BCAT2 和 miR-330-5p,BCKDHB和miR-433-3p 的靶标关系。同时,也揭示了BCAT2在BCAA通路中对脂肪分化的调节机制。主要结果如下:1、培养的绵羊前体细胞呈纺锤形或不规则三角形;随着分化的进行,脂滴由小变大,且越来越透明。油红O染色结果发现着色区域越来越大。在分化过程中PPARγ、C/EBPα、FABP4和ADIPOQ的mRNA表达量呈上升趋势,表明培养的细胞可作为后续试验的绵羊前体脂肪细胞。2、双荧光素酶报告系统检测荧光活性显示:共转染PmirGLO-BCAT2-3’-UTR和miR-330-5pmimics 的荧光活性显著(P<0.05)低于共转染 PmirGLO-BCAT2-3’-UTR 和miR-330-5pNC的荧光活性,也显著(P<0.05)低于空白对照组的荧光活性,表明BCAT2与miR-330-5p有结合位点,两者有靶标关系。共转染PmirGLO-BCKDHB-3’-UTR和miR-433-3pmimics 的荧光活性显著(P<0.05)低于共转染 PmirGLO-BCKDHB-3’-UTR和miR-433-3pNC的荧光活性,也显著(P<0.05)低于空白对照组的荧光活性,表明BCKDHB与miR-433-3p有结合位点,两者有靶标关系。3、过表达miR-330-5p后,过表达组BCAT2mRNA和蛋白的相对表达量显著(P<0.05)低于阴性对照组,说明miR-330-5p不仅下调BCAT2mRNA表达,也下调了其蛋白的表达。过表达miR-433-3p后,过表达组BCKDHBmRNA和蛋白的相对表达量也显著(P<0.05)低于阴性对照组,表明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。4、在分化前期检测到miR-330-5p和BCAT2的mRNA表达量呈负相关,而且miR-433-3p和BCKDHBmRNA的表达量也呈负相关。5、过表达BCAT2后,BCKDHA和BCKDHB的mRNA及蛋白表达量均显著(P<0.05)下降,而敲除BCAT2后,BCKDHA和BCKDHB的mRNA及蛋白表达量均显著(P<0.05)上升,表明BCAT2对BCKDHA和BCKDHB的表达有负调控作用。过表达BCAT2 后,PPARγ、C/EBPα、FABP4 和 ADIPOQ 的表达量显著(P<0.05)上升,油红O染色的结果显示脂滴也显著(P<0.05)增多,而敲除BCAT2后,脂肪分化的标志基因PPARγ、C/EBPα、FABP4和ADIPOQ的表达量及油红O染色的脂滴结果与过表达BCAT2的结果相反。这些结果表明BCAT2对脂肪细胞的分化有促进作用。这些结果充分表明miR-330-5p通过与BCAT2-3’-UTR结合、miR-433-3p通过与BCKDHB-3’-UTR的结合负调节各自靶基因及其编码蛋白的表达,并抑制了绵羊前体脂肪细胞的分化。同时,也阐明在BCAA通路中BCAT2与下游基因有一定程度的负调控关系。为进一步研究miRNA与BCAA通路中的相关基因、及BCAA通路中基因之间互作调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。