论文部分内容阅读
背景肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的癌症,其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的组织学类型,约占所有肺癌的80%,并可进一步分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等。既往欧美肺腺癌人群基因突变研究显示,K-ras最为常见,达32.3%,其次为表皮生长因子受体(EGFR)突变;而关于亚洲NSCLC人群的基因研究中却发现EGFR突变率可高达50%。近年来,针对EGFR敏感突变的抑制剂应用逐渐增多,如一代的厄洛替尼和吉非替尼和二代的阿法替尼。但大部分使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的晚期NSCLC患者在9-13个月陆续出现继发性耐药。目前针对EGFR敏感突变的第一、二代TKI药物的耐药机制已经研究得比较透彻,T790M突变是最主要的耐药机制。而针对T790M突变的第三代EGFR-TKI的代表药物奥希替尼(AZD9291)在中国刚投入临床一线使用不久,我们对其可能出现的耐药机制及后续使用化疗药的情况仍未清楚。因此我们拟深入研究一线使用第三代TKI药物AZD9291后与化疗药物不同联合使用方式后的多药耐药机制,本项目已建立对AZD9291耐药的H1975细胞和PC-9细胞,为后续分析其生物学性状并开展一线使用第三代EGFR-TKI及后续化疗对NSCLC的抗肿瘤作用和耐药机制的研究奠定基础,为指导NSCLC靶向治疗的临床应用提供依据。方法多药耐药株的构建我们选取了非小细胞肺癌A549细胞(EGFR野生型)、NCI-H1975细胞(L858R/T790M错义突变)和PC-9细胞(19外显子缺失),一线使用AZD9291分别作用于以上三株肺癌细胞后,再使用两组不同的AZD9291联合化疗药的方式,诱导多药耐药细胞株。第一组:使用基于铂类的双化疗药物冲击已对AZD9291耐药的NSCLC细胞;第二组:使用AZD9291联合铂类为基础的双化疗药物交替作用于NSCLC细胞。AZD9291耐药细胞株的构建我们选取了非小细胞肺癌A549细胞、NCI-H1975细胞和PC-9细胞,分别诱导建立AZD9291耐药株。根据MTT实验获得的IC50与耐药指数(RI)确认耐药细胞株构建成功。采用克隆形成、粘附、侵袭的细胞功能实验及细胞凋亡实验对比细胞耐药前后的变化。统计学分析使用Graphpad Prism 6.0和SPSS 23.0,采用非线性分析和T检验,P值<0.05认为有统计学差异。结果我们一线使用AZD9291作用于三株肺癌细胞后,再使用两组不同的AZD9291联合化疗药的方式,诱导三药耐药细胞株。诱导13个月后,目前仍继续维持原方案进行三药耐药细胞的诱导。现阶段我们已成功构建对AZD9291耐药的H1975/AR细胞和PC-9/AR细胞。我们使用AZD9291长时间,高浓度处理A549、H1975、PC-9细胞6个月后,获得了对AZD9291稳定耐药的细胞株H1975/AR,最终AZD9291使用200nM维持培养,细胞可正常生长。使用不含药培养基培养2周后进行实验,MTT增殖抑制实验可看出相同浓度的AZD9291对H1975/AR细胞的抑制率远低于亲本细胞(P<0.05),H1975/AR的IC50值为3.354±0.1 M(P=0.002),耐药指数为17.7(高度耐药)。H1975/AR的克隆形成能力、粘附侵袭能力、抗凋亡能力均显著高于亲本细胞(P<0.05)。同样方法诱导对AZD9291耐药的PC-9细胞,6个月后,我们获得AZD9291耐药株(PC-9/AR),可在200nM AZD9291持续培养,生长正常。但使用不含药培养基培养2周后进行实验提示PC-9为不稳定耐药细胞株。MTT增殖抑制实验显示相同浓度AZD9291对PC-9/AR细胞的抑制率明显低于亲本细胞,但没有统计学差异(P=0.0576),计算PC-9/AR的IC50值为2.816±0.556 M,耐药指数为7.24(中度耐药)。PC-9/AR的抗凋亡能力、克隆形成能力、侵袭能力均明显高于亲本细胞,但未达到统计学差异,细胞粘附实验则没有明显趋势。结论1.我们通过高浓度持续诱导法成功获得了对AZD9291耐药的H1975/AR稳定细胞株;2.携带有T790M突变的NCI-H1975细胞比只带有EGFR敏感突变的PC-9细胞对AZD9291更敏感,更容易构建稳定的对AZD9291耐药的细胞系;3.H1975/AR与PC-9/AR耐药细胞株相比亲本细胞,其细胞抗凋亡、生长、侵袭能力明显增强。