论文部分内容阅读
目的：机体的免疫系统受多重机制所调节,其中调节性T(T reg)细胞发挥着重要的负调控作用,在肿瘤微环境中的T reg细胞能够抑制机体对肿瘤的免疫应答,因此T reg细胞已经成为肿瘤免疫治疗的主要障碍。OX40／OX40L是T细胞活化过程中一对重要的共刺激分子,它们之间的相互作用具有抑制天然型T reg细胞的活性、拮抗诱导型T reg细胞产生的作用。近年来研究发现,在黑色素瘤、肺癌及胸腺瘤模型中,利用含OX40L基因的腺病毒转染肿瘤细胞或者树突状细胞(DC),具有明显抑制肿瘤生长的效果。本研究旨在建立基于OX40L真核表达载体的DNA疫苗,并进一步制备稳定表达OX40L的B16细胞作为瘤苗,从而为探索黑素瘤等相关肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法：利用RT-PCR法从小鼠脾脏总RNA中扩增小鼠OX40L基因的cDNA,并将其与载体pVA1连接,构建相应的真核表达载体。将重组质粒转染到B16细胞中,荧光染色检测OX40L的表达,分别利用CFSE和AnnexinV-PE凋亡试剂盒,检测B16黑素瘤细胞-淋巴细胞体外混合培养中对活化淋巴细胞增殖和凋亡的影响；将重组质粒注射荷瘤小鼠体内检测其对黑素瘤的治疗作用。同时,将小鼠OX40L基因的cDNA与载体pEGFP-C3连接,构建其真核表达载体,转染到B16细胞中,利用荧光显微镜观察OX40L的表达。利用G418筛选,分别建立稳定表达EGFP和OX40L-EGFP的B16细胞系。经体外组织形态学观察,细胞增殖,迁移能力,侵袭能力,细胞周期,小鼠成瘤实验综合分析其生物学特性及行为改变,利用流式细胞仪检测瘤体组织细胞EGFP的表达情况。结果：1.从C57BL／6小鼠中成功克隆小鼠OX40L的编码区cDNA,构建了两种真核表达载体,经测序分析显示,OX40L的cDNA序列与GenBank的序列完全一致。2.B16细胞转染pVAX1-OX40L后,流式细胞术和激光共聚焦显微术均可检测到OX40L表达于细胞表面。淋巴细胞体外混合培养显示,表达OX40L的B16细胞组和空质粒转染组活化淋巴细胞的增殖效果：ConA组为26.27%和18.97%,不加ConA组为26.95%和13.95%；表达OX40L的B16细胞组活化淋巴细胞的凋亡率为6.57%,而空质粒转染组为17.24%。小鼠皮下移植瘤模型中,瘤内注射重组质粒对小鼠黑素瘤没有明显治疗效果。3.pEGFP-C3-OX40L真核表达载体转染B16细胞后,荧光显微镜观察显示OX40L获得表达,筛选稳定表达的OX40L-EGFP的B16细胞克隆没有成功：挑取稳定表达EGFP的B16细胞株(B16／EGFP)成功,并可稳定传代,与B16细胞相比,B16／EGFP细胞在形态、迁移能力、侵袭能力以及细胞周期方面没有明显差异；但是,B16／EGFP的增殖活性低于B16细胞,在小鼠腹部皮下接种肿瘤细胞发现,B16／EGFP细胞组的肿瘤生长速度较慢(P<0.05),且肿瘤组织的细胞可检测到EGFP的表达。结论：成功构建了小鼠OX40L的真核表达载体,并在B16细胞中能够进行表达；体外表达OX40L具有明显的生物学活性；EGFP的整合及表达,仅对细胞的生长有一定影响,而对其表型和成瘤能力等影响较小。本研究建立的EGFP为报告基因的稳定细胞株,为进一步研究黑素瘤的转移机制奠定基础。