论文部分内容阅读
背景与目的 生长抑素是一种在人体中广泛分布的激素，通过靶细胞膜上的生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）介导，负性调节多种生理功能。SSTR共有5种亚型，其中2型受体被认为与肿瘤的关系最为密切。SST或生长抑素类似物（somatostatin analogue，SSA）可通过SSTR2抑制肿瘤细胞的增生。胰腺癌中SSTR2表达缺失或是低表达，导致SSA治疗胰腺癌的效果不佳。通过基因转移的方法，将SSTR2基因导入肿瘤细胞内，通过SSTR2在细胞表面的再表达可以进行基因治疗。为此，本研究构建表达人SSTR2的复制缺陷型腺病毒载体，为SSTR2基因治疗胰腺癌奠定基础。 方法 构建重组腺病毒穿梭质粒pDC316-SSTR2和pDC316-Lacz（作为阴性对照使用），通过脂质体与腺病毒骨架质粒pBHGlox（Δ）E1，3Cre共转染293细胞，经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad-SSTR2和Ad-LacZ。通过PCR和Westorn blot鉴定Ad-SSTR2和Ad-LacZ。经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒感染液，用X-gal染色法测定重组腺病毒感染能力。以病毒感染液感染人胰腺癌细胞capan-2，应用RT-PCR、Westorn blot和免疫细胞化学检测SSTR2 mRNA和蛋白的表达。MTT法检测Ad-SSTR2对capan-2细胞生长的影响。 结果 成功构建了腺病毒穿梭质粒pDC316-SSTR2和pDC316-LacZ，与pBHGlox（Δ）E1，3Cre共转染293细胞获得了重组腺病毒Ad-SSTR2和Ad-LacZ。以Ad-SSTR2基因组DNA为模板同时扩增出了人SSTR2 cDNA基因片段和腺病毒骨架基因片段；Ad-SSTR2和Ad-LacZ经扩增、纯化后，病毒滴度分别为6.0×10~9pfu／mL和6.5×10~9pfu／mL；病毒感染效率高，感染复数为10、50、100的腺病毒的感染效率分别为（15.2±3.6）％、（40.3±5.2）％和（100±0.0）％。Ad-SSTR2感染Capan-2后，RT-PCR检测到SSTR2 mRNA的表达，Westorn blot和免疫细胞化学检测到SSTR2蛋白的表达。Ad-SSTR2对capan-2细胞的生长除病毒毒性作用外，SSTR2基因具有一定程度的细胞增殖抑制作用。 结论 成功构建携带人SSTR2基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-SSTR2，经大量扩增和纯化获得高滴度、高感染效率病毒感染液，在胰腺癌细胞中得到正确表