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研究目的新生儿缺氧性脑病是指新生儿在围产期缺氧而引起的脑组织的缺氧性损害,主要由宫内窘迫、新生儿缺氧窒息引起,该疾病多发生在足月儿,有时可发生在早产儿,也可以发生在由其他因素引发的脑组织损害。目前已知,新生儿缺氧性脑损害与星形胶质细胞的增殖和活化有关。我们目前的研究发现,在缺氧刺激下,星形胶质细胞大量增殖,细胞中NICD和Hes-1蛋白表达增多,推测这可能与该细胞中Notch-1因子的激活和表达上调有关。然而,Notch-1在缺氧条件下对星形胶质细胞的调节机制还不是很清楚。因此,本研究利用wistar新生大鼠构建缺氧模型,通过观察缺氧星形胶质细胞中重要分子表达的变化,探寻Notch信号通路在其中可能发挥的作用,并进一步探讨Notch-1信号对星形胶质细胞增殖和活化的影响及其可能的作用机制,以期为人类新生儿缺氧性脑损害的临床防护与治疗提供新途径。研究方法1.应用RT-PCR和蛋白印迹技术分别检测缺氧星形胶质细胞(实验组)和正常氧含量星形胶质细胞(对照组)中Notch-1 mRNA、 Notch-1蛋白、NICD蛋白、Hes-1mRNA、Hes-1蛋白的表达量,抑制Notch信号通路后,观察Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白表达量的变化。2.应用BrdU技术检测星形胶质细胞的细胞增殖,探索Notch信号通路在其中发挥的作用。3.应用RT-PCR技术观测星形胶质细胞中TNF-α和IL-1 β等炎性因子的变化,探讨Notch信号通路对这些因子表达的影响。4.应用RT-PCR技术检测星形胶质细胞中GFAP mRNA、VEGF mRNA的表达,利用蛋白印迹法、ELISA、免疫荧光等技术检测GFAP、 VEGF蛋白的表达情况,探讨抑制Notch信号通路对缺氧的星形胶质细胞中GFAP和VEGF表达的影响。5.应用蛋白印迹法、ELISA、siRNA转染技术观察VEGF和NF-κB的表达情况,探讨缺氧下NF-κ B和VEGF通路对星形胶质细胞增殖和活化的影响。研究结果1.在缺氧刺激下,星形胶质细胞中的Notch信号通路的变化。为了确定在低氧刺激下Notch-1信号是否被活化,我们通过RT-PCR、免疫荧光等技术检测Notch-1基因在星形胶质细胞中的表达量,利用蛋白质印记法检测Notch-1这种蛋白质的表达情况。结果显示,低氧刺激下,Notch-1的mRNA表达明显增高。免疫荧光结果显示,与空白对照组相比,低氧环境下星形胶质细胞中的Notch-1明显增加。蛋白质印记法显示,低氧环境下Notch-1蛋白的表达也增多了。由于Notch-1表达的升高,我们进一步探索低氧处理过的星形胶质细胞中Notch信号通路的活化情况。结果显示,12hH寸,与对照组相比,低氧星形胶质细胞中NICD蛋白表达增多。通过免疫荧光的结果可以看出,低氧下NICD在星形胶质细胞的细胞质和细胞核中(尤其是细胞核中)的荧光强度比对照组强。低氧下6h、12h时,星形胶质细胞中Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白的表达升高,用DAPT处理后,其表达受抑制。2. DAPT对Notch信号通路的影响本研究通过BrdU来检测星形胶质细胞的细胞增殖,进而探索Notch信号通路在其中发挥的作用。缺氧刺激12h后,BrdU阳性的细胞与总的细胞数的比值从31.7±3.8%增长到了48.4±4.5%；而用DAPT处理过的细胞,BrdU阳性细胞的比率下降到了31±5%3. Notch信号通路对星形胶质细胞分泌的TNF-α和IL-1 β这些炎性因子的影响缺氧导致了星形胶质细胞中TNF-α和IL-1 β的mRNA表达量的明显提高,在用DAPT处理过的星形胶质细胞中,TNF-α的mRNA的表达变化不大, IL-1 β的mRNA的表达受到了明显的抑制。ELISA实验结果显示,DAPT处理过的星形胶质细胞中IL-1 β蛋白的表达量明显减少,TNF-α蛋白的表达量没有明显变化。4. DAPT对缺氧的星形胶质细胞中GFAP和VEGF表达的影响抑制星形胶质细胞中的Notch信号通路导致GFAP的mRNA表达明显降低。RT-PCR的结果显示,在用DAPT处理过的星形胶质细胞中,VEGF的mRNA的表达受到了明显的抑制。ELISA的结果显示,DAPT处理过的星形胶质细胞中,VEGF的分泌减少。在缺氧的星形胶质细胞中,VEGF的表达量明显高于对照组,但这种现象在经过DAPT处理后消失。蛋白质印记法结果显示,低氧条件下的脑组织VEGF的表达明显高于空白对照组,然而用DAPT处理后,低氧下,VEGF蛋白的表达量下降。5.低氧下NF-κB和VEGF通路对星形胶质细胞增殖和活化的影响蛋白印迹法和ELISA实验结果显示,低氧下星形胶质细胞中NF-κB/p65表达明显升高,经DAPT处理后其表达下降。siRNA敲除VEGF和NF-κB后,抑制了星形胶质细胞的增值和活化。研究结论1.在低氧环境下,原代培养的星形胶质细胞中Notch被活化。2. Notch可以被DAPT阻滞,从而抑制了星形胶质细胞的增殖。3.在星形胶质细胞中被阻滞了的Notch信号通路抑制了炎性因子IL-1 β的产生,对炎性因子TNF-α的影响不大。4.经过DAPT处理过的缺氧的星形胶质细胞抑制了GFAP和VEGF的表达。5.抑制NF-κB和VEGF通路能抑制缺氧的星形胶质细胞的增殖和活化。