背景众所周知,恶性肿瘤最重要的生物特性是侵袭和转移,这也是肿瘤病人的主要临床致死原因。据不完全统计,约70%的肿瘤病人在临床确诊时已经存在肿瘤转移。尤其是死亡率占前几位的肿瘤,如肺癌,胃癌,肝癌等,临床病人确诊时,往往已经处于中晚期,通常肿瘤一旦发生转移,常规临床治疗效果不佳,死亡率极高。早在1971年,Folkman首先发现了肿瘤血管形成因子(TAF) ,并认为抑制肿瘤血管生成(angiogenesis)能有效的抑制肿瘤的生长、转移和复发。目前这一观点已经得到广泛的证实。近年的研究表明,实体肿瘤生长至1mm3以上时即需要新生血管形成;否则肿瘤停止生长,静止于休眠状态(dormantstate),瘤体维持在2～3mm3以内,细胞数在107以内;并且肿瘤维持在原位(insitu)达数月或数年,不会发生转移。而一旦肿瘤细胞获得血管生成表型(angiogenicphenotype),便可诱导血管生成,肿瘤建立起新生血管网,从而促进肿瘤快速生长,其转移潜能也迅即出现。因此,抗血管生成,切断肿瘤恶性生长的供养途径,并阻断肿瘤侵袭转移的血行通道,致使肿瘤静止于休眠状态,可有效遏制肿瘤的恶性行为,是治疗肿瘤的有效策略。目前,血管生成抑制剂的研究主要有如下4种策略:(1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力;(2)直接抑制内皮细胞的功能;(3)阻断血管生成因子的合成和释放,拮抗其作用;(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用。arresten是Colorado等发现的一种强效的血管生成抑制因子,它属于Ⅳ型胶原α1链的羧基末端NC1结构域多肽片段,其分子量为26kd。研究发现,arresten抑制血管生成的作用显著强于内皮素,而且其蛋白结构稳定,因此有望成为肿瘤血管生成抑制剂。本课题组在先前的研究中,对原核表达的arresten抑制血管生成作用进行了一些探讨。原核表达虽产量高,但产物的重复性差、活性低,而中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是目前常用的真核表达体系,它可较长时间地表达所携带的基因而不衰减,并能稳定地大量表达,其表达产生的蛋白质具有糖基化、磷酸化等修饰,具有良好的生物活性,因此被广泛用于蛋白表达和疫苗生产。本研究通过CHO细胞株真核表达并纯化arresten蛋白,探讨其抑制血管生成的分子生物学机制,并观察arresten基因转染对结肠癌肝转移的抑制作用。目的建立arresten的真核表达体系,获得纯化的arresten蛋白;观察arresten对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管腔形成的影响,了解其对内皮细胞与肿瘤细胞黏附的影响;并探讨其相关的分子生物学机制;观察arresten基因转染对裸鼠实验性结肠癌肝转移的抑制效果,探讨arresten在肿瘤转移治疗中的应用前景。方法用脂质体Lipofectamine2000通过基因转染将arresten基因导入CHO细胞,建立arresten蛋白的真核表达体系,经过纯化获得arresten蛋白;观察arresten对huvec细胞增殖、迁移、细胞黏附和管腔形成的影响;应用RT-PCR、Western-blot等实验方法,检测VEGF和VCAM-1的表达;通过基因转染将arresten基因导入结肠癌LOVO细胞株,建立裸鼠实验性结肠癌肝转移的模型,观察arresten基因转染对肿瘤转移的抑制作用,FⅧRag多克隆抗体染色的免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度(MVD),进一步证实arresten抑制肿瘤转移的作用途径。结果RT-PCR及Western-blot证实arresten成功导入CHO细胞并在mRNA及蛋白水平高表达,表明成功建立arresten的真核表达体系,经过纯化得到arresten蛋白。体外实验表明,arresten能抑制内皮细胞的增殖和迁移,进而抑制血管腔形成,而其相关作用机制可能与arresten降低huvec细胞的VEGF表达有关。arresten还能通过抑制内皮细胞VCAM-1的表达进而抑制内皮细胞与肿瘤细胞的黏附。体内实验表明,arresten基因转染能抑制实验性裸鼠结肠癌肝转移,抑制肿瘤血管生成是其作用途径。结论arresten能抑制血管生成,并能抑制细胞黏附,此两种方式可能是其抑制肿瘤转移的作用途径;arresten作用机制与其降低内皮细胞VEGF和VCAM-1表达有关。Arresten能抑制肿瘤转移,有望成为有效抑制肿瘤转移的生物制剂。