论文部分内容阅读
目的：观察CIC-3氯通道在一氧化氮(NO)供体SIN-1诱导大鼠海马神经元凋亡过程中的表达，探讨氯通道在缺血性脑损伤中的作用。
方法：采用培养12天的SD大鼠海马神经元，随机分为Control组、SIN-1组和SIN-1+DIDS组，每组设6个复孔。实验时，SIN-1的作用时间是18小时；SIN-1+DIDS组中，DIDS与SIN-1同时加入培养基中，作用18小时。采用MTT法检测细胞生存率、Hoechst33342荧光染色和caspase-3凋亡蛋白测定检测细胞凋亡、细胞免疫荧光染色、免疫印迹和实时定量PCR检测CIC-3氯通道的表达。
结果：(1)SIN-1诱导神经元凋亡具有浓度依赖性，随SIN-1浓度的增加其诱导神经元凋亡的作用明显增强。0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mmol/L浓度的SIN-1细胞生存率分别为101.10±1.66％、88.60±2.01％、72.59±3.31％、69.52±1.00％、57.89±1.98％、44.30±2.66％、11.84±0.66％，0.2-2.0mmol/L各组与0mmol/L组相比具有统计学差异(P<0.001，n=6)。1.0mmol/L的SIN-1可显著诱导神经元发生凋亡，在之后实验中采用此浓度建立神经元凋亡的模型。(2)氯通道阻断剂DIDS呈浓度依赖性提高细胞生存率，抑制SIN-1诱导培养大鼠海马神经元凋亡的损伤作用。正常组的细胞生存率是100.20±0.92％，0、10、50、100、200、300μmol/L浓度的DIDS细胞生存率分别为58.99±3.70％、76.36±1.22％、73.74±0.93％、86.26±1.26％、78.79±1.60％、68.69±1.27％，10-200μmol/L各组与0μmol/L组相比具有统计学差异(P<0.001，n=6)，在之后实验中DIDS均采用100μmol/L浓度。(3)Hoechst33342对神经元核染色显示，正常组中神经元胞核呈卵圆形或锥形，呈淡蓝色荧光，凋亡发生率为5.56±0.81％；SIN-1(1.0mmol/L)组中神经元胞核浓缩、变小，呈强亮色荧光，凋亡发生率为51.06±2.38％，与Control组相比具有显著性差别(P<0.001，n=6)；SIN-1+DIDS(100μmol/L)组的细胞凋亡发生率为21.61±1.36％，与SIN-1组相比具有显著性差别(P<0.001，n=6)。(4)细胞免疫荧光染色显示，正常培养12天的海马神经元细胞膜上CIC-3氯通道的表达呈阳性；而在SIN-1(1.0mmol/L)诱导的凋亡神经元细胞膜上CIC-3氯通道的表达增强；SIN-1+DIDS(100μmol/L)组中CIC-3氯通道表达减弱。(5)Western blot结果显示，Control组中CIC-3蛋白相对表达量是0.37±0.07；SIN-1(1.0mmol/L)组中CIC-3蛋白相对表达量是1.73±0.24，与Control组相比具有显著性差别(P<0.001，n=6)；SIN-1+DIDS组中CIC.3蛋白相对表达量是0.99±0.18，与SIN-1组相比具有显著性差别(P<0.001，n=6)。(6)real-time PCR实验结果显示，Control组中CIC-3 mRNA相对表达量是0.33±0.11；SIN-1(1.0mmol/L)组中CIC-3 mRNA相对表达量是11.99±4.76，与Control组相比，P<0.05(n=3)；SIN-1+DIDS组中CIC-3mRNA相对表达量是6.23±1.17，与SIN-1组相比，P<0.05(n=3)。
结论：SIN-1处理的海马神经元CIC-3氯通道呈现高表达，过量的NO参与了缺血性脑损伤，C1C-3氯通道可能参与了SIN-1诱导的大鼠海马神经元的凋亡。